Expressions PPAR, RXR et VDR dans le diabète

Le présent protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique du comité d'éthique médicale de l'Université Tokat Gaziosmanpasa. L'étude a été conçue comme une étude clinique transversale et menée au département de parodontologie de la faculté de médecine dentaire de l'Université Tokat Gaziosmanpaşa. Un consentement éclairé a été obtenu de tous les participants et un examen oral et radiologique détaillé a été effectué par un clinicien expérimenté (H.B.Y.).

Quarante-deux participants, 14 participants dans chaque groupe, ont été inscrits à l'étude. Les groupes d'étude étaient les suivants.

Témoins sains (C, âge moyen 41,05±1,80, sept hommes, sept femmes) Patients atteints de parodontite de stade 3 grade B, (P, âge moyen 42,35 ± 1,92, sept hommes, sept femmes) Patients atteints de diabète et de parodontite de stade 3 grade C, (DP, âge moyen 41,09 ± 1,28, sept hommes, sept femmes)

Tous les patients et les individus en bonne santé ont subi un examen oral détaillé, et le diagnostic de la santé parodontale et de la parodontite était basé sur les critères définis par la récente classification de la santé et des maladies parodontales dans l'Atelier mondial international de 2017 pour une classification des maladies et affections parodontales [21] .

Tous les participants n'avaient jamais fumé. Les critères d'exclusion étaient les affections susceptibles d'affecter l'état inflammatoire, l'existence de moins de dix dents manquantes ou plus, la consommation de tabac ou de toute drogue, la présence d'une grossesse ou de l'allaitement et l'existence d'un traitement antibiotique ou parodontal au cours des six mois précédents. Les patients diabétiques de la présente étude avaient des valeurs d'HbA1c supérieures à 7,0 même s'ils étaient sous traitement diabétique. Et les patients diabétiques qui avaient des valeurs d'HbA1c inférieures à 7,0 n'ont pas été inclus.

Mesures cliniques Les paramètres cliniques étaient l'indice de plaque (PI), l'indice gingival (GI) et les niveaux d'attache clinique (CAL), et toutes les analyses ont été effectuées avant la procédure de biopsie. Les mesures de la bouche complète et les mesures des dents concernées ont été enregistrées séparément. La CAL a été mesurée de la jonction ciment-émail au fond de la poche parodontale et une sonde parodontale de type Williams a été utilisée pour les mesures (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Les mesures PI et GI ont été effectuées via un explorateur (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Toutes les analyses ont été effectuées à partir de six points, trois de l'aspect vestibulaire et trois de l'aspect palatin en tant que sites mésiaux, moyens et distaux pour les deux dents. Une valeur moyenne de six mesures a été enregistrée.

Prélèvement d'échantillons gingivaux Des biopsies gingivales ont été obtenues selon un protocole d'une étude antérieure [22]. Deux biopsies gingivales ont été obtenues de chaque participant. L'échantillonnage gingival chez les individus en bonne santé parodontale a été effectué par la procédure d'allongement de la couronne dans le protocole de traitement de routine ou avant l'extraction dentaire indiquée par l'orthodontie. Dans les groupes de parodontite, des biopsies ont été obtenues à partir du tissu gingival enflammé avec des interventions chirurgicales parodontales mineures. Toutes les biopsies ont été obtenues à partir de dents maxillaires postérieures (dent #4, #5, #6 ou #7).

Tout d'abord, une anesthésie locale a été réalisée et un échantillon gingival a été disséqué avec des ciseaux à tissus d'une zone nécessitant soit des procédures de gingivectomie/d'allongement de la couronne chez des patients présentant une topographie gingivale altérée, soit avant une extraction dentaire indiquée pour un traitement orthodontique chez des individus en bonne santé. Comme pour les patients atteints de parodontite, un échantillon gingival a été disséqué à l'aide d'un ciseau à tissu pendant la procédure de détartrage et de surfaçage radiculaire à partir des zones gingivales présentant une inflammation gingivale sévère. Un échantillon gingival de chaque participant a été immédiatement placé dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 48 heures et a subi un traitement histologique des tissus. Les autres échantillons de chaque participant ont été immédiatement congelés à -80⁰C jusqu'au jour de l'analyse.

Évaluation histopathologique Toutes les procédures histologiques ont été réalisées par un chercheur expérimenté en aveugle (F.G.). Les échantillons gingivaux qui ont subi un traitement histologique des tissus ont d'abord été lavés et nettoyés du formol et ont été déshydratés avec des séries d'alcool. Ensuite, tous les tissus ont été nettoyés avec du xylène et inclus dans des blocs de paraffine. Chaque bloc sectionné en sections en série et trois sections de chaque bloc ont été sélectionnés pour la coloration à l'hématoxyline-éosine (H&E). L'infiltration de fibroblastes et de cellules inflammatoires a été évaluée à partir de lames colorées H&E sous un grossissement de 1000x via un microscope optique .

Pour l'évaluation des fibroblastes et des cellules inflammatoires, la zone gingivale à la frontière du tissu conjonctif voisine de l'épithélium gingival a été évaluée. Un cadre de comptage de cellules d'une surface de 10 000 µm2 a été sélectionné sous un grossissement de 1000x. Les cellules inflammatoires totales (cellules neutrophiles, lymphocytes, éosinophiles et macrophages) dans le cadre ont été comptées comme comptage des cellules inflammatoires. Les fibroblastes ont également été comptés de la même manière. Les mesures ont été effectuées à partir de trois points différents et la moyenne de ces trois mesures a été enregistrée [23].

PPAR-γ, RXR-α et VDR Immunohistochimie L'immunohistochimie a été réalisée comme indiqué dans les études précédentes [23-26]. Trois sections ont été choisies pour chaque coloration immunohistochimique de chaque participant. Tout d'abord, toutes les lames ont été déparaffinées et déshydratées avec une série d'alcools. Après lavage à l'eau distillée, la récupération de l'antigène a été effectuée via un tampon de citrate de sodium (pH 6,0) pendant deux heures à 70 ° C, puis l'activité peroxydase endogène a été supprimée avec un traitement au peroxyde d'hydrogène à 3%. Après traitement au peroxyde d'hydrogène, toutes les lames ont été incubées avec du sérum de lapin normal pendant 30 min. Après une incubation normale du sérum, des diluants d'anticorps primaires ont été préparés et appliqués aux échantillons pendant une nuit dans une chambre humidifiée à 4⁰C. Les anticorps primaires étaient l'anticorps polyclonal de chèvre anti-PPAR-γ (1:250), l'anticorps anti-RXR-α (1:250) et l'anticorps anti-VDR (1:250). Après incubation primaire d'anticorps, toutes les lames ont été lavées avec une solution tampon phosphate (PBS) trois fois pendant cinq minutes (3x5) et de l'immunoglobuline G biotinylée a été appliquée pendant 30 minutes. Encore une fois un lavage de 3x5 PBS, tous les échantillons ont été exposés à un réactif conjugué à la streptavidine-peroxydase de raifort pendant 30 minutes supplémentaires. Après avoir été lavées avec du PBS 3x5, toutes les sections ont été traitées avec du chromogène AEC pour visualiser la coloration. La contre-coloration a été réalisée avec de l'hématoxyline de Meyer et les coupes ont été montées. Après avoir laissé sécher pendant deux jours, les échantillons ont été examinés sous un grossissement de 400x en utilisant la microscopie optique [23, 24].

Analyse immunohistochimique semi-quantitative H SCORE L'évaluation immunohistochimique a été effectuée sur trois zones différentes dans chaque section, et trois sections ont été évaluées pour chaque patient. Neuf mesures ont été effectuées pour chaque participant. Toutes les cellules ont été marquées en fonction de leur coloration comme aucune coloration « 0 », faible coloration « 1 », légère coloration « 2 » et coloration dense « 3 ». Les scores de coloration ont été convertis en une valeur numérique en tant que "score H" via une formule (∑Pi(i+l)) qui est une valeur fréquemment utilisée pour l'immunohistochimie [23, 24]. Dans cette formule, i montre le score d'intensité de coloration et Pi : indique le pourcentage de cellules colorées.

Analyse RT-PCR Les amorces à utiliser pour les gènes sont présentées dans le tableau 1. L'isolement de l'ARN et l'analyse RT-PCR réalisée selon une étude précédente [27]. En bref, pour l'analyse RT-PCR, les premiers tissus gingivaux ont été homogénéisés et soumis à une sonication pour révéler l'ARN dans les tissus et les surnageants tissulaires ont été obtenus. Ensuite, les surnageants ont été soumis à l'étape d'isolement de l'ARNm total. Les tissus traités au Qiazole, puis laissés à incuber dans l'agitateur pendant 5 minutes. Au bout de 5 minutes, du chloroforme a été ajouté au milieu contenant les cellules et l'incubation a été poursuivie pendant 3 minutes à température ambiante puis les échantillons ont été centrifugés. A la fin de la centrifugeuse, le surnageant en haut du tube est transféré dans un autre tube. Ensuite, de l'isopropanol a été ajouté au surnageant et incubé pendant 10 minutes à température ambiante, et l'étape de centrifugation a été répétée. A la fin de la centrifugation, le culot déposé au fond a été lavé avec de l'éthanol à 75%, le surnageant restant a été centrifugé à nouveau et mis en suspension dans de l'eau pure et stérile sans RNase. Les ARNm ont été déterminés par méthode spectrophotométrique. Ensuite, en utilisant le kit qRT-PCR, un µg d'ARNm a été transformé en ADNc en une seule étape à l'aide d'amorces spécifiques ciblant le gène d'intérêt, puis les gènes ont été identifiés à l'aide de qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Les résultats ont été normalisés au gène de contrôle de la β-actine.

Analyse statistique La puissance de l'étude était supérieure à 85 % sur la base d'une étude précédente avec une conception d'étude similaire [25]. Le logiciel IBM SPSS a été utilisé pour l'analyse statistique. Un test K-S d'échantillon a été utilisé pour tester la normalité. Pour les comptages de cellules fibroblastiques, les comptages de cellules inflammatoires et CAL, One Way ANOVA suivi du test de Tukey utilisé. Pour les autres paramètres, les tests Mann Whitney U et Kruskal Wallis ont été utilisés. Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET ou de pourcentage, selon le cas. p < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.