Espressioni PPAR, RXR e VDR nel diabete

Il presente protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico del Comitato etico medico dell'Università Tokat Gaziosmanpasa. Lo studio è stato concepito come uno studio clinico trasversale e condotto presso il Dipartimento di Parodontologia della Facoltà di Odontoiatria dell'Università Tokat Gaziosmanpaşa. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i partecipanti e un dettagliato esame orale e radiologico è stato eseguito da un medico esperto (H.B.Y.).

Quarantadue partecipanti, 14 partecipanti in ciascun gruppo, sono stati arruolati nello studio. I gruppi di studio erano i seguenti.

Controlli sani (Cmax, età media 41,05±1,80, sette uomini, sette donne) Pazienti con parodontite allo stadio 3 grado B, (P, età media 42,35±1,92, sette uomini, sette donne) Pazienti con diabete e parodontite con stadio 3 grado C, (DP, età media 41,09±1,28, sette uomini, sette donne)

Tutti i pazienti e gli individui sani sono stati sottoposti a un esame orale dettagliato e la diagnosi della salute parodontale e della parodontite si è basata sui criteri definiti dalla recente classificazione della salute e delle malattie parodontali nell'International World Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions del 2017 [21]. .

Tutti i partecipanti non sono mai stati fumatori. I criteri di esclusione erano condizioni che potevano influenzare lo stato infiammatorio, l'esistenza di meno di dieci o più denti mancanti, l'uso di tabacco o droghe, la presenza di gravidanza o allattamento e l'esistenza di terapia antibiotica o parodontale nei sei mesi precedenti. I pazienti diabetici nel presente studio avevano valori di HbA1c superiori a 7,0 anche se erano in trattamento per il diabete. E i pazienti diabetici che avevano valori di HbA1c inferiori a 7,0 non sono stati inclusi.

Misurazioni cliniche I parametri clinici erano indice di placca (PI), indice gengivale (GI) e livelli di attacco clinico (CAL) e tutte le analisi sono state eseguite prima della procedura di biopsia. Le misurazioni della bocca intera e le misurazioni dei denti rilevanti sono state registrate separatamente. CAL è stato misurato dalla giunzione cemento-smalto al fondo della tasca parodontale e per le misurazioni è stata utilizzata la sonda parodontale di tipo Williams (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Le misurazioni PI e GI sono state eseguite tramite un esploratore (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Tutte le analisi sono state eseguite da sei punti, tre dall'aspetto buccale e tre dall'aspetto palatale come siti mesiali, medi e distali per entrambi i denti. È stato registrato un valore medio di sei misurazioni.

Raccolta di campioni gengivali Le biopsie gengivali sono state ottenute secondo un protocollo da uno studio precedente [22]. Sono state ottenute due biopsie gengivali da ciascun partecipante. Il campionamento gengivale in individui parodontalmente sani è stato eseguito mediante procedura di allungamento della corona nel protocollo di trattamento di routine o prima dell'estrazione del dente indicata ortodonticamente. Nei gruppi di parodontite, le biopsie sono state ottenute dal tessuto gengivale infiammato con procedure parodontali chirurgiche minori. Tutte le biopsie sono state ottenute da denti mascellari posteriori (dente n. 4, n. 5, n. 6 o n. 7).

In primo luogo, è stata eseguita l'anestesia locale e un campione gengivale è stato sezionato con una forbice di tessuto da un'area che richiedeva procedure di gengivectomia/allungamento della corona da pazienti con topografia gengivale compromessa o prima dell'estrazione del dente indicata per il trattamento ortodontico in individui sani. Per quanto riguarda i pazienti con parodontite, un campione gengivale è stato sezionato utilizzando una forbice tissutale durante la procedura di ablazione e pianificazione radicolare dalle aree gengivali con grave infiammazione gengivale. Un campione gengivale di ciascun partecipante è stato immediatamente posto in formalina tamponata neutra al 10% per 48 ore e sottoposto a processazione istologica del tessuto. Gli altri campioni di ciascun partecipante sono stati immediatamente congelati a -80⁰C fino al giorno dell'analisi.

Valutazione istopatologica Tutte le procedure istologiche sono state eseguite da un ricercatore esperto in cieco (F.G.). I campioni gengivali sottoposti a trattamento istologico del tessuto sono stati prima lavati e puliti dalla formalina e sono stati disidratati con una serie di alcool. Quindi tutti i tessuti sono stati ripuliti con xilene e incorporati in blocchi di paraffina. Ciascun blocco sezionato come sezioni seriali e tre sezioni di ciascun blocco sono state selezionate per la colorazione con ematossilina-eosina (H&E). L'infiltrazione di fibroblasti e cellule infiammatorie è stata valutata da vetrini colorati con H&E con ingrandimento 1000x tramite un microscopio ottico .

Per la valutazione dei fibroblasti e delle cellule infiammatorie, è stata valutata l'area gengivale al bordo del tessuto connettivo vicino all'epitelio gengivale. Un frame di conteggio delle cellule di 10.000 µm2 di area è stato selezionato con un ingrandimento di 1000x. Le cellule infiammatorie totali (cellule di neutrofili, linfociti, eosinofili e macrofagi) all'interno del frame sono state contate come conteggio delle cellule infiammatorie. Anche i fibroblasti sono stati contati allo stesso modo. Le misurazioni sono state eseguite da tre punti diversi e la media di queste tre misurazioni è stata registrata [23].

PPAR-γ, RXR-α e VDR Immunoistochimica L'immunoistochimica è stata eseguita come riportato in studi precedenti [23-26]. Sono state scelte tre sezioni per ciascuna colorazione immunoistochimica da ciascun partecipante. In primo luogo, tutti i vetrini sono stati deparaffinati e disidratati con una serie di alcol. Dopo il lavaggio con acqua distillata, il recupero dell'antigene è stato eseguito tramite tampone di citrato di sodio (pH 6,0) per due ore a 70°C, quindi l'attività della perossidasi endogena è stata soppressa con il trattamento con perossido di idrogeno al 3%. Dopo il trattamento con perossido di idrogeno, tutti i vetrini sono stati incubati con normale siero di coniglio per 30 minuti. Dopo la normale incubazione del siero, i diluenti dell'anticorpo primario sono stati preparati e applicati ai campioni durante la notte in una camera umidificata a 4⁰C. Gli anticorpi primari erano l'anticorpo policlonale di capra anti-PPAR-γ (1:250), l'anticorpo anti-RXR-α (1:250) e l'anticorpo anti-VDR (1:250). Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, tutti i vetrini sono stati lavati con soluzione tampone fosfato (PBS) tre volte per cinque minuti (3x5) e l'immunoglobulina G biotinilata è stata applicata per 30 minuti. Ancora una volta un lavaggio di PBS 3x5, tutti i campioni sono stati esposti a un reagente coniugato con streptavidina-perossidasi di rafano per altri 30 minuti. Dopo il lavaggio con PBS 3x5, tutte le sezioni sono state trattate con cromogeno AEC per visualizzare la colorazione. La controcolorazione è stata eseguita con l'ematossilina di Meyer e le sezioni sono state montate. Dopo aver lasciato asciugare per due giorni, i campioni sono stati esaminati con un ingrandimento di 400x utilizzando la microscopia ottica [23, 24].

Analisi immunoistochimica semi-quantitativa H SCORE La valutazione immunoistochimica è stata eseguita su tre diverse aree in ciascuna sezione e sono state valutate tre sezioni per ciascun paziente. Sono state eseguite nove misurazioni per ciascun partecipante. Tutte le cellule sono state contrassegnate in base alla loro colorazione come nessuna colorazione "0", colorazione bassa "1", colorazione lieve "2" e colorazione densa "3". I punteggi di colorazione sono stati convertiti in un valore numerico come "punteggio H" attraverso una formula (∑Pi(i+l)) che è un valore frequentemente utilizzato per l'immunoistochimica [23, 24]. In questa formula, i mostra il punteggio dell'intensità della colorazione e Pi: indica la percentuale delle cellule colorate.

Analisi RT-PCR I primer da utilizzare per i geni sono stati mostrati nella tabella 1. L'isolamento dell'RNA e l'analisi RT-PCR eseguita secondo uno studio precedente [27]. In breve, per l'analisi RT-PCR, i primi tessuti gengivali sono stati omogeneizzati e sottoposti a sonicazione per rivelare l'RNA nei tessuti e sono stati ottenuti surnatanti tissutali. Quindi i surnatanti sono stati sottoposti alla fase di isolamento totale dell'mRNA. I tessuti trattati con Qiazole, poi lasciati incubare nell'agitatore per 5 minuti. Al termine dei 5 minuti, al terreno contenente le cellule è stato aggiunto cloroformio e l'incubazione è proseguita per 3 minuti a temperatura ambiente e quindi i campioni sono stati centrifugati. Alla fine della centrifuga, il supernatante nella parte superiore della provetta è stato trasferito in un'altra provetta. Successivamente, isopropanolo è stato aggiunto al supernatante e incubato per 10 minuti a temperatura ambiente, e la fase di centrifugazione è stata ripetuta. Al termine della centrifugazione, il pellet depositato sul fondo è stato lavato con etanolo al 75%, il supernatante rimanente è stato nuovamente centrifugato e sospeso in acqua pura sterile priva di RNasi. Gli mRNA sono stati determinati mediante metodo spettrofotometrico. Quindi, utilizzando il kit qRT-PCR, un µg di mRNA è stato trasformato in cDNA a passaggio singolo utilizzando primer specifici mirati al gene di interesse, successivamente i geni sono stati identificati con l'aiuto di qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . I risultati sono stati normalizzati al gene di controllo della β-actina.

Analisi statistica La potenza dello studio era superiore all'85% sulla base di uno studio precedente con un disegno di studio simile [25]. Il software IBM SPSS è stato utilizzato per l'analisi statistica. Un test Sample K-S è stato utilizzato per testare la normalità. Per la conta delle cellule dei fibroblasti, la conta delle cellule infiammatorie e la CAL, è stato utilizzato l'ANOVA a una via seguito dal test di Tukey. Per altri parametri sono stati utilizzati i test di Mann Whitney U e Kruskal Wallis. I dati sono stati presentati come media ± SD o percentuale a seconda dei casi. p <0,05 sono stati considerati statisticamente significativi.