PPAR-, RXR- ja VDR-ilmentymät diabeteksessa

Tämä tutkimusprotokolla on Tokat Gaziosmanpasan yliopiston lääketieteellisen eettisen toimikunnan eettisen komitean hyväksymä. Tutkimus suunniteltiin poikkileikkauskliiniseksi tutkimukseksi ja se suoritettiin Tokat Gaziosmanpaşan yliopiston hammaslääketieteellisen tiedekunnan parodontologian laitoksella. Kaikilta osallistujilta saatiin tietoinen suostumus, ja kokenut kliinikko (H.B.Y.) suoritti yksityiskohtaisen suullisen ja radiologisen tutkimuksen.

Tutkimukseen osallistui 42 osallistujaa, 14 osallistujaa kussakin ryhmässä. Opintoryhmät olivat seuraavat.

Terveet kontrollit (C, keski-ikä 41,05±1,80, seitsemän miestä, seitsemän naista) Parodontiittipotilaat, joilla on aste 3 B, (P, keski-ikä 42,35±1,92, seitsemän miestä, seitsemän naista) Diabetes- ja parodontiittipotilaat, joilla on aste 3 C, (DP, keski-ikä 41,09±1,28, seitsemän miestä, seitsemän naista)

Kaikki potilaat ja terveet henkilöt kävivät läpi yksityiskohtaisen suututkimuksen, ja parodontaalin terveys ja parodontiittidiagnoosi perustuivat 2017 International World Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions -luokituksen kriteereihin [21]. .

Kaikki osallistujat eivät koskaan olleet tupakoitsijoita. Poissulkemiskriteereinä olivat tilat, jotka saattoivat vaikuttaa tulehdustilaan, alle kymmenen tai useamman hampaan puuttuminen, tupakan tai minkä tahansa huumeiden käyttö, raskaus tai imetys sekä antibiootti- tai parodontaalihoidon olemassaolo edellisen kuuden kuukauden aikana. Tämän tutkimuksen diabeetikoilla oli HbA1c-arvot yli 7,0, vaikka he olivat diabeetikon hoidossa. Ja diabeetikkopotilaita, joiden HbA1c-arvot olivat alle 7,0, ei otettu mukaan.

Kliiniset mittaukset Kliiniset parametrit olivat plakkiindeksi (PI), ienindeksi (GI) ja kliinisen kiinnittymisen tasot (CAL), ja kaikki analyysit suoritettiin ennen biopsiamenettelyä. Koko suun mittaukset ja asiaankuuluvien hampaiden mittaukset kirjattiin erikseen. CAL mitattiin sementti-emali liitoksesta parodontaalitaskun pohjaan ja mittauksiin käytettiin Williamsin tyyppistä parodontaalianturia (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). PI- ja GI-mittaukset suoritettiin tutkimuslaitteen (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA) kautta. Kaikki analyysit suoritettiin kuudesta pisteestä, kolme bukkaalista ja kolme palataalisesta kohdasta molempien hampaiden mesiaali-, keski- ja distaalisista kohdista. Kuuden mittauksen keskiarvo kirjattiin.

Iennäytteiden kerääminen Ienbiopsiat saatiin aikaisemman tutkimuksen protokollan mukaisesti [22]. Jokaiselta osallistujalta otettiin kaksi ienbiopsiaa. Iennäytteenotto periodontaalisesti terveillä yksilöillä suoritettiin kruununpidennystoimenpiteellä rutiinihoitoprotokollassa tai ennen oikomishoidolla osoitettua hampaanpoistoa. Parodontiittiryhmissä biopsiat otettiin tulehtuneesta ienkudoksesta pienillä kirurgisilla parodontaalitoimenpiteillä. Kaikki biopsiat otettiin takaleuan hampaista (hammas #4, #5, #6 tai #7).

Ensin tehtiin paikallispuudutus ja leikattiin iennäyte kudossaksilla alueelta, joka vaati joko ienpoistoa/kruununpidennystä potilailta, joilla oli ientopografian heikkeneminen tai ennen hampaanpoistoa, joka oli tarkoitettu oikomishoitoon terveille henkilöille. Parodontiittipotilailta leikattiin iennäyte kudossaksilla hilseilyn ja juurisuunnittelun aikana ienalueilta, joilla oli vaikea ientulehdus. Yksi iennäyte jokaiselta osallistujalta sijoitettiin välittömästi 10 % neutraaliin puskuroituun formaliiniin 48 tunniksi ja sille tehtiin histologinen kudoskäsittely. Muut kunkin osallistujan näytteet pakastettiin välittömästi -80 °C:seen analyysipäivään asti.

Histopatologinen arviointi Kaikki histologiset toimenpiteet suoritti kokenut sokea tutkija (F.G.). Histologisen kudoskäsittelyn läpikäyneet iennäytteet pestiin ja puhdistettiin ensin formaliinista ja dehydratoitiin alkoholisarjoilla. Sitten kaikki kudokset puhdistettiin ksyleenillä ja upotettiin parafiinilohkoihin. Jokainen kappale, joka oli leikattu kauttaaltaan sarjaleikkeiksi, ja kustakin lohkosta valittiin kolme osaa hematoksyliini-eosiini (H&E) -värjäystä varten. Fibroblastien ja tulehdussolujen infiltraatio arvioitiin H&E-värjätyistä objektilaseista 1000-kertaisella suurennuksella valomikroskoopilla.

Fibroblastien ja tulehdussolujen arviointia varten arvioitiin ienalue sidekudoksen rajalla ienepiteelin vieressä. Solulaskentakehys, jonka pinta-ala oli 10 000 µm, valittiin 1000-kertaisella suurennuksella. Tulehdussolujen kokonaismäärä (neutrofiili-, lymfosyytti-, eosinofiili- ja makrofagisolut) kehyksen sisällä laskettiin tulehdussolujen laskennaksi. Myös fibroblastit laskettiin samoin. Mittaukset suoritettiin kolmesta eri pisteestä, ja näiden kolmen mittauksen keskiarvo kirjattiin [23].

PPAR-y-, RXR-a- ja VDR-immunohistokemia Immunohistokemia suoritettiin aiempien tutkimusten mukaisesti [23-26]. Jokaiselta osallistujalta valittiin kolme leikettä kullekin immunohistokemialliseen värjäykseen. Ensinnäkin kaikista objektilaseista tehtiin parafiini ja dehydratointi alkoholisarjoilla. Tislatulla vedellä pesun jälkeen suoritettiin antigeenin talteenotto natriumsitraattipuskurilla (pH 6,0) kahden tunnin ajan 70 °C:ssa, minkä jälkeen endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus tukahdutettiin 3-prosenttisella vetyperoksidikäsittelyllä. Vetyperoksidikäsittelyn jälkeen kaikkia levyjä inkuboitiin normaalin kanin seerumin kanssa 30 minuuttia. Normaalin seerumin inkubaation jälkeen valmistettiin primaariset vasta-ainelaimennusaineet ja levitettiin näytteille yön yli kostutetussa kammiossa 4 °C:ssa. Ensisijaiset vasta-aineet olivat vuohen polyklonaalinen anti-PPAR-y-vasta-aine (1:250), anti-RXR-a-vasta-aine (1:250) ja anti-VDR-vasta-aine (1:250). Primaarisen vasta-aineinkuboinnin jälkeen kaikki objektilasit pestiin fosfaattipuskuriliuoksella (PBS) kolme kertaa viiden minuutin ajan (3 x 5) ja biotinyloitua immunoglobuliini G:tä lisättiin 30 minuutin ajan. Jälleen pesu 3 x 5 PBS:llä, kaikki näytteet altistettiin streptavidiini-piparjuuriperoksidaasilla konjugoidulle reagenssille vielä 30 minuutin ajan. 3 x 5 PBS:llä pesun jälkeen kaikki leikkeet käsiteltiin AEC-kromogeenilla värjäytymisen visualisoimiseksi. Vastavärjäys suoritettiin Meyerin hematoksyliinillä ja leikkeitä asennettiin. Kun näytteet oli annettu kuivua kaksi päivää, ne tutkittiin 400-kertaisella suurennuksella käyttämällä valomikroskopiaa [23, 24].

Immunohistokemiallinen puolikvantitatiivinen H SCORE -analyysi Immunohistokemiallinen arviointi suoritettiin kolmella eri alueella kussakin osassa, ja jokaiselle potilaalle arvioitiin kolme osaa. Jokaiselle osallistujalle tehtiin yhdeksän mittausta. Kaikki solut merkittiin niiden värjäytymisen mukaan värjäytymättömäksi '0', heikosti värjäytyväksi '1', lieväksi värjäytymiseksi '2' ja tiheäksi värjäytymiseksi '3'. Värjäyspisteet muutettiin numeerisiksi arvoiksi 'H-pisteiksi' kaavan (∑Pi(i+l)) avulla, joka on usein käytetty arvo immunohistokemiassa [23, 24]. Tässä kaavassa i näyttää värjäytymisintensiteetin ja Pi: osoittaa värjäytyneiden solujen prosenttiosuuden.

RT-PCR-analyysi Geeneille käytettävät alukkeet on esitetty taulukossa 1. RNA:n eristäminen ja RT-PCR-analyysi suoritettiin aikaisemman tutkimuksen mukaisesti [27]. Lyhyesti sanottuna RT-PCR-analyysiä varten ensimmäiset ienkudokset homogenisoitiin ja sonikoitiin RNA:n paljastamiseksi kudoksissa ja saatiin kudossupernatantit. Sitten supernatantit alistettiin kokonais-mRNA:n eristysvaiheeseen. Kudokset käsiteltiin Qiatsolilla, minkä jälkeen niiden annettiin inkuboitua ravistelijassa 5 minuuttia. 5 minuutin kuluttua kloroformia lisättiin solut sisältävään väliaineeseen ja inkubointia jatkettiin 3 minuuttia huoneenlämpötilassa ja sitten näytteet sentrifugoitiin. Sentrifugin lopussa putken yläosassa oleva supernatantti siirtyi toiseen putkeen. Sen jälkeen isopropanolia lisättiin supernatanttiin ja inkuboitiin 10 minuuttia huoneenlämpötilassa, ja sentrifugointivaihe toistettiin. Sentrifugoinnin lopussa pohjalle kerrostunut pelletti pestiin 75-prosenttisella etanolilla, jäljelle jäänyt supernatantti sentrifugoitiin uudelleen ja suspendoitiin puhtaaseen, steriiliin veteen ilman RNaasia. mRNA:t määritettiin spektrofotometrisellä menetelmällä. Sitten qRT-PCR-kittiä käyttäen transformoitiin yksi µg mRNA:ta yksivaiheiseksi cDNA:ksi käyttämällä spesifisiä alukkeita, jotka kohdistuivat kiinnostavaan geeniin, myöhemmin geenit tunnistettiin qRT-PCR:n avulla (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Tulokset normalisoitiin p-aktiinikontrolligeeniin.

Tilastollinen analyysi Tutkimuksen teho oli yli 85 % perustuen aikaisempaan tutkimukseen, jossa oli samanlainen tutkimussuunnitelma [25]. Tilastolliseen analyysiin käytettiin IBM SPSS -ohjelmistoa. Normaaliuden testaamiseen käytettiin yhtä K-S-näytteen testiä. Fibroblastisolujen, tulehdussolujen ja CAL:n määrittämiseen käytettiin One Way ANOVA:ta ja sen jälkeen Tukey-testiä. Muille parametreille käytettiin Mann Whitney U- ja Kruskal Wallis -testejä. Tiedot esitettiin keskiarvona ± SD tai prosentteina tarpeen mukaan. p < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.