PPAR-, RXR- en VDR-expressies bij diabetes

Het huidige studieprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Medical Ethics Committee van de Tokat Gaziosmanpasa University. De studie was opgezet als een cross-sectionele klinische studie en werd uitgevoerd aan de Tokat Gaziosmanpaşa Universiteit Faculteit der Tandheelkunde Afdeling Parodontologie. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers en gedetailleerd mondeling en radiologisch onderzoek werd uitgevoerd door een ervaren clinicus (H.B.Y.).

Tweeënveertig deelnemers, 14 deelnemers in elke groep, namen deel aan het onderzoek. De studiegroepen waren als volgt.

Gezonde controles (C, gemiddelde leeftijd 41,05 ± 1,80, zeven mannen, zeven vrouwen) Parodontitispatiënten met stadium 3 graad B, (P, gemiddelde leeftijd 42,35 ± 1,92, zeven mannen, zeven vrouwen) Patiënten met diabetes en parodontitis met stadium 3 graad C (DP, gemiddelde leeftijd 41,09 ± 1,28, zeven mannen, zeven vrouwen)

Alle patiënten en gezonde personen ondergingen een gedetailleerd mondeling onderzoek en de diagnose van parodontale gezondheid en parodontitis was gebaseerd op de criteria die zijn gedefinieerd door de recente classificatie van parodontale gezondheid en ziekten in de 2017 International World Workshop for a Classification of Parodontitis Diseases and Conditions [21] .

Alle deelnemers waren nooit rokers. Uitsluitingscriteria waren aandoeningen die de inflammatoire toestand kunnen beïnvloeden, het bestaan ​​van minder dan tien of meer ontbrekende tanden, tabak of drugsgebruik, de aanwezigheid van zwangerschap of borstvoeding, en het bestaan ​​van antibiotica of parodontale therapie in de afgelopen zes maanden. Diabetespatiënten in de huidige studie hadden HbA1c-waarden hoger dan 7,0, ook al waren ze onder diabetesbehandeling. En de diabetespatiënten met HbA1c-waarden lager dan 7,0 werden niet meegenomen.

Klinische metingen Klinische parameters waren plaque-index (PI), gingivale index (GI) en klinische hechtingsniveaus (CAL), en alle analyses werden uitgevoerd vóór de biopsieprocedure. Metingen van de volledige mond en de afmetingen van de betreffende tanden werden afzonderlijk geregistreerd. CAL werd gemeten vanaf de cement-emailverbinding tot de bodem van de parodontale pocket en Williams' type parodontale sonde werd gebruikt voor metingen (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, VS). PI- en GI-metingen werden uitgevoerd via een ontdekkingsreiziger (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, VS). Alle analyses werden uitgevoerd vanaf zes punten, drie vanuit het buccale aspect en drie vanuit het palatinale aspect als mesiale, middelste en distale plaatsen voor beide tanden. Er werd een gemiddelde waarde van zes metingen geregistreerd.

Verzameling van tandvleesmonsters Gingivale biopsieën werden verkregen volgens een protocol van een eerder onderzoek [22]. Van elke deelnemer werden twee tandvleesbiopten verkregen. Gingivale bemonstering bij parodontaal gezonde personen werd uitgevoerd door middel van een kroonverlengingsprocedure in het routinebehandelingsprotocol of vóór orthodontisch geïndiceerde tandextractie. In de parodontitisgroepen werden met kleine chirurgische parodontale ingrepen biopten verkregen van het ontstoken tandvlees. Alle biopsieën werden verkregen van achterste maxillaire tanden (tand #4, #5, #6 of #7).

Ten eerste werd lokale anesthesie uitgevoerd en werd een tandvleesmonster ontleed met een weefselschaar uit een gebied waar gingivectomie/kroonverlengingsprocedures nodig waren bij patiënten met een aangetaste gingivale topografie of voordat tandextractie geïndiceerd was voor orthodontische behandeling bij gezonde personen. Wat de patiënten met parodontitis betreft, werd een tandvleesmonster ontleed met behulp van een weefselschaar tijdens de scaling- en wortelplanningsprocedure uit de tandvleesgebieden met ernstige tandvleesontsteking. Eén tandvleesmonster van elke deelnemer werd onmiddellijk gedurende 48 uur in 10% neutraal gebufferde formaline geplaatst en onderging histologische weefselverwerking. De andere monsters van elke deelnemer werden onmiddellijk ingevroren bij -80⁰C tot de dag van analyse.

Histopathologische evaluatie Alle histologische procedures werden uitgevoerd door een ervaren geblindeerde onderzoeker (F.G.). Tandvleesmonsters die histologische weefselverwerking ondergingen, werden eerst gewassen en gereinigd van formaline en werden gedehydrateerd met alcoholseries. Vervolgens werden alle weefsels geklaard met xyleen en ingebed in paraffineblokken. Elk blok werd doorgesneden als seriële secties en drie secties van elk blok werden geselecteerd voor kleuring met hematoxyline-eosine (H&E). Fibroblast- en ontstekingscelinfiltratie werden geëvalueerd van met H&E gekleurde objectglaasjes onder een vergroting van 1000x via een lichtmicroscoop .

Voor evaluatie van fibroblasten en ontstekingscellen werd het tandvleesgebied aan de bindweefselgrens naast het gingivale epitheel geëvalueerd. Een celtelraam van 10.000 µm2 oppervlakte werd geselecteerd onder 1000x vergroting. Het totale aantal ontstekingscellen (neutrofielen, lymfocyten, eosinofielen en macrofaagcellen) binnen het frame werd geteld als telling van ontstekingscellen. De fibroblasten werden eveneens geteld. De metingen zijn uitgevoerd vanaf drie verschillende punten en het gemiddelde van deze drie metingen is geregistreerd [23].

PPAR-γ, RXR-α en VDR Immunohistochemie Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals gerapporteerd in eerdere studies [23-26]. Drie secties werden gekozen voor elke immunohistochemische kleuring van elke deelnemer. Ten eerste werden alle dia's gedeparaffineerd en gedehydrateerd met alcoholreeksen. Na wassen met gedestilleerd water werd antigeen-terugwinning uitgevoerd via natriumcitraatbuffer (pH 6,0) gedurende twee uur bij 70 °C, en vervolgens werd de endogene peroxidase-activiteit onderdrukt met een behandeling met 3% waterstofperoxide. Na behandeling met waterstofperoxide werden alle objectglaasjes gedurende 30 minuten geïncubeerd met normaal konijnenserum. Na normale serumincubatie werden primaire antilichaamverdunningsmiddelen bereid en gedurende de nacht op de monsters aangebracht in een bevochtigde kamer bij 4⁰C. De primaire antilichamen waren polyklonaal geiten-anti-PPAR-y-antilichaam (1:250), anti-RXR-a-antilichaam (1:250) en anti-VDR-antilichaam (1:250). Na primaire antilichaamincubatie werden alle objectglaasjes driemaal gewassen met fosfaatbufferoplossing (PBS) gedurende vijf minuten (3x5) en gebiotinyleerd immunoglobuline G werd gedurende 30 minuten aangebracht. Opnieuw een wasbeurt van 3x5 PBS, alle monsters werden nog eens 30 minuten blootgesteld aan een streptavidine-mierikswortelperoxidase-geconjugeerd reagens. Na wassen met 3x5 PBS werden alle secties behandeld met AEC-chromogeen om kleuring zichtbaar te maken. Tegenkleuring werd uitgevoerd met Meyer's hematoxyline en secties werden gemonteerd. Na twee dagen drogen werden de monsters onderzocht onder een vergroting van 400x met behulp van lichtmicroscopie [23, 24].

Immunohistochemische semi-kwantitatieve H SCORE-analyse Immunohistochemie-evaluatie werd uitgevoerd op drie verschillende gebieden in elke sectie en drie secties werden geëvalueerd voor elke patiënt. Voor elke deelnemer werden negen metingen uitgevoerd. Alle cellen werden volgens hun kleuring gemarkeerd als geen kleuring '0', weinig kleuring '1', milde kleuring '2' en dichte kleuring '3'. Kleuringsscores werden omgezet in een numerieke waarde als 'H-score' via een formule (∑Pi(i+l)), een veelgebruikte waarde voor immunohistochemie [23, 24]. In deze formule geeft i de kleuringsintensiteitsscore weer en Pi: geeft het percentage gekleurde cellen aan.

RT-PCR-analyse De voor de genen te gebruiken primers zijn weergegeven in tabel 1. De RNA-isolatie en RT-PCR-analyse uitgevoerd volgens een eerder onderzoek [27]. In het kort, voor RT-PCR-analyse werden de eerste gingivale weefsels gehomogeniseerd en onderworpen aan sonicatie om RNA in de weefsels te onthullen en weefselsupernatanten werden verkregen. Vervolgens werden de supernatanten onderworpen aan de totale mRNA-isolatiestap. De weefsels behandeld met Qiazole, daarna 5 minuten incuberen in de shaker. Na afloop van 5 minuten werd chloroform toegevoegd aan het medium dat de cellen bevatte en werd de incubatie gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur voortgezet en daarna werden de monsters gecentrifugeerd. Aan het einde van de centrifuge werd het supernatant aan de bovenkant van de buis overgebracht naar een andere buis. Daarna werd isopropanol aan het supernatant toegevoegd en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd, en de centrifugatiestap werd herhaald. Aan het einde van de centrifugatie werd de op de bodem neergeslagen pellet gewassen met 75% ethanol, het resterende supernatant werd opnieuw gecentrifugeerd en gesuspendeerd in zuiver, steriel water zonder RNase. mRNA's werden bepaald door spectrofotometrische methode. Vervolgens werd met behulp van de qRT-PCR-kit één μg mRNA getransformeerd in eenstaps-cDNA met behulp van specifieke primers gericht op het gen van interesse, later werden de genen geïdentificeerd met behulp van qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VS). . De resultaten werden genormaliseerd naar het β-actine-controlegen.

Statistische analyse De power van de studie was meer dan 85% op basis van een eerdere studie met een vergelijkbare onderzoeksopzet [25]. IBM SPSS-software werd gebruikt voor statistische analyse. Eén Sample K-S-test werd gebruikt om de normaliteit te testen. Voor de fibroblastceltellingen, ontstekingsceltellingen en CAL werd One Way ANOVA gevolgd door Tukey-test gebruikt. Voor andere parameters werden Mann Whitney U- en Kruskal Wallis-tests gebruikt. Gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD of percentage, naargelang het geval. p < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.