PPAR, RXR og VDR udtryk i diabetes

Den nuværende undersøgelsesprotokol blev godkendt af den etiske komité for den medicinske etiske komité ved Tokat Gaziosmanpasa University. Undersøgelsen var designet som et tværsnits klinisk undersøgelse og udført på Tokat Gaziosmanpaşa University Faculty of Dentistry Department of Parodontologi. Informeret samtykke blev indhentet fra alle deltagere, og detaljeret mundtlig og radiologisk undersøgelse blev udført af en erfaren kliniker (H.B.Y.).

Toogfyrre deltagere, 14 deltagere i hver gruppe, blev tilmeldt undersøgelsen. Studiegrupperne var som følger.

Sunde kontroller (C, gennemsnitsalder 41,05±1,80, syv mænd, syv kvinder) Paradentosepatienter med stadium 3 grad B, (P, gennemsnitsalder 42,35±1,92, syv mænd, syv kvinder) Patienter med diabetes og paradentose med stadium 3 grad C, (DP, gennemsnitsalder 41,09±1,28, syv mænd, syv kvinder)

Alle patienter og raske personer gennemgik en detaljeret mundtlig undersøgelse, og diagnosticering af periodontal sundhed og paradentose var baseret på kriterierne defineret af den nylige klassifikation af periodontal sundhed og sygdomme i 2017 International World Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions [21] .

Alle deltagere var aldrig rygere. Eksklusionskriterier var tilstande, der kunne påvirke den inflammatoriske tilstand, eksistensen af ​​mindre end ti eller derover manglende tænder, tobaks- eller medicinbrug, tilstedeværelse af graviditet eller amning og eksistensen af ​​antibiotika eller parodontalbehandling inden for de foregående seks måneder. Diabetespatienter i denne undersøgelse havde HbA1c-værdier større end 7,0, selvom de var under diabetesbehandling. Og de diabetespatienter, der havde HbA1c-værdier under 7,0, var ikke inkluderet.

Kliniske målinger Kliniske parametre var plakindeks (PI), gingivalindeks (GI) og kliniske tilknytningsniveauer (CAL), og alle analyser blev udført før biopsiproceduren. Målinger af fuld mund og målinger af de relevante tænder blev registreret separat. CAL blev målt fra cement-emaljeforbindelsen til bunden af ​​den parodontale lomme, og Williams type parodontale probe blev brugt til målinger (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). PI- og GI-målinger blev udført via en opdagelsesrejsende (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Alle analyser blev udført fra seks punkter, tre fra det bukkale aspekt og tre fra det palatale aspekt som mesiale, midterste og distale steder for begge tænder. En middelværdi på seks målinger blev registreret.

Indsamling af tandkødsprøver Gingivalbiopsier blev opnået i henhold til en protokol fra en tidligere undersøgelse [22]. To gingivalbiopsier blev opnået fra hver deltager. Gingival prøvetagning hos parodontalt raske individer blev udført ved kroneforlængelseprocedure i rutinebehandlingsprotokol eller før ortodontisk indiceret tandudtrækning. I parodontitisgrupperne blev der taget biopsier fra det betændte tandkødsvæv med mindre kirurgiske parodontale indgreb. Alle biopsier blev opnået fra bageste maksillære tænder (tand #4, #5, #6 eller #7).

Først blev der udført lokalbedøvelse, og en tandkødsprøve blev dissekeret med en vævssaks fra et område med behov for enten gingivektomi/kroneforlængelse fra patienter med nedsat tandkødstopografi eller før tandudtrækning indiceret til ortodontisk behandling hos raske personer. Hvad angår parodontitispatienterne, blev en tandkødsprøve dissekeret ved hjælp af en vævssaks under skæl- og rodplanlægningsproceduren fra tandkødsområderne med alvorlig tandkødsbetændelse. Én tandkødsprøve fra hver deltager blev straks anbragt i 10 % neutral bufret formalin i 48 timer og undergik histologisk vævsbehandling. De andre prøver af hver deltager blev straks frosset ved -80⁰C indtil analysedagen.

Histopatologisk evaluering Alle histologiske procedurer blev udført af en erfaren blindet forsker (F.G.). Gingivalprøver, som gennemgik histologisk vævsbehandling, blev først vasket og renset for formalin og blev dehydreret med alkoholserier. Derefter blev alle væv renset med xylen og indlejret i paraffinblokke. Hver blok sektioneret igennem som serielle snit, og tre sektioner fra hver blok blev udvalgt til hæmatoxylin-eosin (H&E)-farvning. Fibroblast- og inflammatorisk celleinfiltration blev evalueret fra H&E-farvede objektglas under 1000x forstørrelse via et lysmikroskop.

Til evaluering af fibroblaster og inflammatoriske celler blev tandkødsområdet ved bindevævsgrænsen ved siden af ​​tandkødsepitelet evalueret. En celletællingsramme på 10.000 µm2 areal blev udvalgt under 1000x forstørrelse. De samlede inflammatoriske celler (neutrofile, lymfocyt-, eosinofile og makrofagceller) inden for rammen blev talt som inflammatorisk celletælling. Fibroblasterne blev også talt på samme måde. Målingerne blev udført fra tre forskellige punkter, og middelværdien af ​​disse tre målinger blev registreret [23].

PPAR-γ, RXR-α og VDR immunhistokemi Immunhistokemi blev udført som rapporteret i tidligere undersøgelser [23-26]. Tre sektioner blev valgt for hver immunhistokemi-farvning fra hver deltager. For det første blev alle objektglas afparaffineret og dehydreret med alkoholserier. Efter vask med destilleret vand blev antigenudvinding udført via natriumcitratbuffer (pH 6,0) i to timer ved 70°C, og derefter blev endogen peroxidaseaktivitet undertrykt med 3% hydrogenperoxidbehandling. Efter hydrogenperoxidbehandling blev alle objektglas inkuberet med normalt kaninserum i 30 min. Efter normal seruminkubation blev primære antistoffortyndingsmidler fremstillet og påført prøverne natten over i et befugtet kammer ved 4°C. De primære antistoffer var gedepolyklonalt anti-PPAR-y-antistof (1:250), anti-RXR-a-antistof (1:250) og anti-VDR-antistof (1:250). Efter primær antistofinkubation blev alle objektglas vasket med phosphatbufferopløsning (PBS) tre gange i fem minutter (3x5), og biotinyleret immunoglobulin G blev påført i 30 minutter. Igen en vask af 3x5 PBS blev alle prøver udsat for et streptavidin-peberrodsperoxidase-konjugeret reagens i yderligere 30 minutter. Efter vask med 3x5 PBS blev alle sektioner behandlet med AEC-kromogen for at visualisere farvning. Modfarvning blev udført med Meyers hæmatoxylin, og sektioner blev monteret. Efter at have ladet dem tørre i to dage, blev prøverne undersøgt under 400x forstørrelse ved hjælp af lysmikroskopi [23, 24].

Immunhistokemisk semikvantitativ H SCORE-analyse Immunhistokemi-evaluering blev udført på tre forskellige områder i hver sektion, og tre sektioner blev evalueret for hver patient. Der blev udført ni målinger for hver deltager. Alle celler blev markeret i henhold til deres farvning som ingen farvning '0', lav farvning '1', mild farvning '2' og tæt farvning '3'. Farvningsscore blev konverteret til en numerisk værdi som 'H-score' gennem en formel (∑Pi(i+l)), som er en hyppigt anvendt værdi for immunhistokemi [23, 24]. I denne formel viser i farvningsintensitetsscore og Pi: angiver procentdelen af ​​de farvede celler.

RT-PCR-analyse De primere, der skal anvendes til generne, er vist i tabel 1. RNA-isolering og RT-PCR-analyse udført i henhold til en tidligere undersøgelse [27]. Kort fortalt, til RT-PCR-analyse blev det første tandkødsvæv homogeniseret og udsat for sonikering for at afsløre RNA i vævene, og vævssupernatanter blev opnået. Derefter blev supernatanterne underkastet det totale mRNA-isoleringstrin. Vævene behandlet med Qiazol, fik derefter lov til at inkubere i rysteren i 5 minutter. Efter 5 minutter blev chloroform tilsat til mediet indeholdende cellerne, og inkubation fortsatte i 3 minutter ved stuetemperatur, hvorefter prøverne blev centrifugeret. Ved slutningen af ​​centrifugen blev supernatanten i toppen af ​​røret overført til et andet rør. Derefter blev isopropanol tilsat til supernatanten og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur, og centrifugeringstrinnet blev gentaget. Ved afslutningen af ​​centrifugeringen blev pelleten aflejret i bunden vasket med 75 % ethanol, den resterende supernatant blev centrifugeret igen og suspenderet i rent, sterilt vand uden RNase. mRNA'er blev bestemt ved spektrofotometrisk metode. Ved hjælp af qRT-PCR-kittet blev et µg mRNA transformeret til enkelt-trins cDNA ved hjælp af specifikke primere rettet mod genet af interesse, senere blev generne identificeret ved hjælp af qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Resultaterne blev normaliseret til β-actin kontrolgenet.

Statistisk analyse Studiets styrke var over 85 % baseret på et tidligere studie med et lignende studiedesign [25]. IBM SPSS-software blev brugt til statistisk analyse. En prøve K-S test blev brugt til at teste normaliteten. For fibroblastcelletællinger, inflammatoriske celletællinger og CAL anvendes One Way ANOVA efterfulgt af Tukey test. For andre parametre blev Mann Whitney U og Kruskal Wallis test brugt. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD eller procentdel efter behov. p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikante.