Expressões de PPAR, RXR e VDR em Diabetes

O presente protocolo de estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Comitê de Ética Médica da Universidade Tokat Gaziosmanpasa. O estudo foi concebido como um estudo clínico transversal e conduzido na Faculdade de Odontologia da Universidade Tokat Gaziosmanpaşa, Departamento de Periodontologia. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes, e o exame oral e radiológico detalhado foi realizado por um clínico experiente (H.B.Y.).

Quarenta e dois participantes, 14 participantes em cada grupo, foram incluídos no estudo. Os grupos de estudo foram os seguintes.

Controles saudáveis ​​(C, idade média 41,05±1,80, sete homens, sete mulheres) Pacientes com periodontite com estágio 3 grau B, (P, idade média 42,35±1,92, sete homens, sete mulheres) Pacientes com diabetes e periodontite com estágio 3 grau C, (DP, idade média 41,09±1,28, sete homens, sete mulheres)

Todos os pacientes e indivíduos saudáveis ​​passaram por um exame bucal detalhado, e o diagnóstico de saúde periodontal e periodontite foi baseado nos critérios definidos pela recente classificação de saúde e doenças periodontais no Workshop Mundial Internacional de 2017 para Classificação de Doenças e Condições Periodontais [21] .

Todos os participantes nunca foram fumantes. Os critérios de exclusão foram condições que pudessem afetar o estado inflamatório, existência de menos de dez dentes perdidos ou mais, uso de tabaco ou qualquer outra droga, presença de gravidez ou lactação e existência de antibioticoterapia ou terapia periodontal nos últimos seis meses. Os pacientes diabéticos do presente estudo apresentaram valores de HbA1c superiores a 7,0, mesmo estando em tratamento para diabetes. E os pacientes diabéticos que apresentaram valores de HbA1c abaixo de 7,0 não foram incluídos.

Medições clínicas Os parâmetros clínicos foram índice de placa (PI), índice gengival (GI) e níveis de inserção clínica (CAL), e todas as análises foram realizadas antes do procedimento de biópsia. As medidas da boca inteira e as medidas dos dentes relevantes foram registradas separadamente. O CAL foi medido da junção cimento-esmalte até o fundo da bolsa periodontal e a sonda periodontal tipo Williams foi usada para medições (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, EUA). As medições de PI e GI foram realizadas por meio de um explorador (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, EUA). Todas as análises foram realizadas a partir de seis pontos, três da face vestibular e três da face palatina como locais mesial, médio e distal para ambos os dentes. Um valor médio de seis medições foi registrado.

Coleta de Amostras Gengivais As biópsias gengivais foram obtidas de acordo com um protocolo de um estudo anterior [22]. Duas biópsias gengivais foram obtidas de cada participante. A amostragem gengival em indivíduos periodontalmente saudáveis ​​foi realizada pelo procedimento de aumento da coroa no protocolo de tratamento de rotina ou antes da extração dentária indicada ortodonticamente. Nos grupos de periodontite, as biópsias foram obtidas do tecido gengival inflamado com pequenos procedimentos cirúrgicos periodontais. Todas as biópsias foram obtidas de dentes superiores posteriores (dente #4, #5, #6 ou #7).

Primeiramente, foi realizada anestesia local e uma amostra gengival foi dissecada com uma tesoura de tecido de uma área que requer procedimentos de gengivectomia/alongamento de coroa de pacientes com topografia gengival prejudicada ou antes da extração de dentes indicados para tratamento ortodôntico em indivíduos saudáveis. Quanto aos pacientes com periodontite, uma amostra gengival foi dissecada usando uma tesoura de tecido durante o procedimento de raspagem e alisamento radicular das áreas gengivais com inflamação gengival severa. Uma amostra gengival de cada participante foi imediatamente colocada em formalina tamponada neutra a 10% por 48 horas e submetida ao processamento histológico do tecido. As demais amostras de cada participante foram imediatamente congeladas a -80⁰C até o dia da análise.

Avaliação histopatológica Todos os procedimentos histológicos foram realizados por um pesquisador cego experiente (F.G.). As amostras gengivais que foram submetidas ao processamento histológico do tecido foram primeiramente lavadas e limpas de formalina e desidratadas com álcool em série. Em seguida, todos os tecidos foram limpos com xileno e incluídos em blocos de parafina. Cada bloco seccionado ao longo como seções seriadas e três seções de cada bloco foram selecionadas para coloração com hematoxilina-eosina (H&E). A infiltração de fibroblastos e células inflamatórias foi avaliada a partir de lâminas coradas com H&E sob ampliação de 1000x através de um microscópio de luz.

Para avaliação de fibroblastos e células inflamatórias, a área gengival na borda do tecido conjuntivo adjacente ao epitélio gengival foi avaliada. Um quadro de contagem de células de 10.000 µm2 de área foi selecionado sob ampliação de 1000x. O total de células inflamatórias (células de neutrófilos, linfócitos, eosinófilos e macrófagos) dentro do quadro foi contado como contagem de células inflamatórias. Os fibroblastos também foram contados da mesma forma. As medidas foram realizadas em três pontos diferentes, sendo registrada a média dessas três medidas [23].

PPAR-γ, RXR-α e VDR Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica foi realizada conforme relatado em estudos anteriores [23-26]. Três seções foram escolhidas para cada coloração imuno-histoquímica de cada participante. Primeiramente, todas as lâminas foram desparafinizadas e desidratadas com série alcoólica. Após lavagem com água destilada, a recuperação antigênica foi realizada via tampão citrato de sódio (pH 6,0) por duas horas a 70°C e, em seguida, a atividade da peroxidase endógena foi suprimida com tratamento com peróxido de hidrogênio a 3%. Após o tratamento com peróxido de hidrogênio, todas as lâminas foram incubadas com soro normal de coelho por 30 minutos. Após a incubação normal do soro, os diluentes de anticorpos primários foram preparados e aplicados às amostras durante a noite em uma câmara umidificada a 4⁰C. Os anticorpos primários foram anticorpo policlonal de cabra anti-PPAR-γ (1:250), anticorpo anti-RXR-α (1:250) e anticorpo anti-VDR (1:250). Após a incubação do anticorpo primário, todas as lâminas foram lavadas com solução tampão fosfato (PBS) três vezes por cinco minutos (3x5) e a imunoglobulina G biotinilada foi aplicada por 30 minutos. Novamente uma lavagem de 3x5 PBS, todas as amostras foram expostas a um reagente conjugado estreptavidina-rábano peroxidase por mais 30 min. Depois de lavadas com 3x5 PBS, todas as seções foram tratadas com cromogênio AEC para visualizar a coloração. A contracoloração foi realizada com hematoxilina de Meyer e os cortes foram montados. Depois de deixar secar por dois dias, as amostras foram examinadas sob ampliação de 400x usando microscopia de luz [23, 24].

Análise imuno-histoquímica semi-quantitativa H SCORE A avaliação imuno-histoquímica foi realizada em três áreas diferentes em cada seção, e três seções foram avaliadas para cada paciente. Nove medições foram realizadas para cada participante. Todas as células foram marcadas de acordo com sua coloração como sem coloração '0', baixa coloração '1', coloração suave '2' e coloração densa '3'. Os escores de coloração foram convertidos em um valor numérico como 'escore H' por meio de uma fórmula (∑Pi(i+l)), que é um valor frequentemente usado para imuno-histoquímica [23, 24]. Nesta fórmula, i mostra a pontuação de intensidade de coloração e Pi: indica a porcentagem de células coradas.

Análise RT-PCR Os primers a serem usados ​​para os genes foram mostrados na tabela 1. O isolamento do RNA e a análise por RT-PCR foram realizados de acordo com um estudo anterior [27]. Resumidamente, para análise de RT-PCR, os primeiros tecidos gengivais foram homogeneizados e submetidos a sonicação para revelar o RNA nos tecidos e os sobrenadantes dos tecidos foram obtidos. Em seguida, os sobrenadantes foram submetidos à etapa de isolamento total do mRNA. Os tecidos tratados com Qiazol, então deixados para incubar no agitador por 5 minutos. Ao final de 5 minutos, o clorofórmio foi adicionado ao meio contendo as células e a incubação continuou por 3 minutos em temperatura ambiente e então as amostras foram centrifugadas. No final da centrifugação, o sobrenadante no topo do tubo é transferido para outro tubo. Em seguida, adicionou-se isopropanol ao sobrenadante e incubou-se por 10 minutos à temperatura ambiente, repetindo-se a etapa de centrifugação. Ao final da centrifugação, o pellet depositado no fundo foi lavado com etanol 75%, o sobrenadante restante foi novamente centrifugado e suspenso em água pura e estéril sem RNase. mRNAs foram determinados pelo método espectrofotométrico. Em seguida, usando o kit qRT-PCR, um µg de mRNA foi transformado em cDNA de etapa única usando primers específicos direcionados ao gene de interesse, posteriormente os genes foram identificados com a ajuda de qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA) . Os resultados foram normalizados para o gene de controle de β-actina.

Análise estatística O poder do estudo foi superior a 85% com base em um estudo anterior com um desenho de estudo semelhante [25]. O software IBM SPSS foi utilizado para análise estatística. Um teste Sample K-S foi usado para testar a normalidade. Para as contagens de células de fibroblastos, contagens de células inflamatórias e CAL, One Way ANOVA seguido pelo teste de Tukey usado. Para os demais parâmetros, foram utilizados os testes Mann Whitney U e Kruskal Wallis. Os dados foram apresentados como média ± DP ou porcentagem, conforme apropriado. p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.