PPAR-, RXR- och VDR-uttryck vid diabetes

Det aktuella studieprotokollet godkändes av den etiska kommittén för den medicinska etiska kommittén vid Tokat Gaziosmanpasa University. Studien utformades som en tvärsnittsstudie och genomfördes vid Tokat Gaziosmanpaşa University Faculty of Dentistry Department of Parodontology. Informerat samtycke erhölls från alla deltagare, och detaljerad oral och radiologisk undersökning utfördes av en erfaren läkare (H.B.Y.).

Fyrtiotvå deltagare, 14 deltagare i varje grupp, inkluderades i studien. Studiegrupperna var följande.

Friska kontroller (C, medelålder 41,05±1,80, sju män, sju kvinnor) Parodontitpatienter med stadium 3 grad B, (P, medelålder 42,35±1,92, sju män, sju kvinnor) Patienter med diabetes och parodontit med stadium 3 grad C, (DP, medelålder 41,09±1,28, sju män, sju kvinnor)

Alla patienter och friska individer genomgick en detaljerad muntlig undersökning, och diagnosen av parodontit hälsa och parodontit baserades på kriterierna som definierats av den senaste klassificeringen av parodontit hälsa och sjukdomar i 2017 International World Workshop for a Classification of Parodontala sjukdomar och tillstånd [21] .

Alla deltagare var aldrig rökare. Uteslutningskriterier var tillstånd som kan påverka det inflammatoriska tillståndet, förekomsten av färre än tio eller fler saknade tänder, tobak eller annan droganvändning, förekomst av graviditet eller amning och förekomst av antibiotika- eller parodontitbehandling under de föregående sex månaderna. Diabetespatienter i denna studie hade HbA1c-värden högre än 7,0 trots att de var under diabetesbehandling. Och de diabetespatienter som hade HbA1c-värden under 7,0 inkluderades inte.

Kliniska mätningar Kliniska parametrar var plackindex (PI), gingivalindex (GI) och kliniska anknytningsnivåer (CAL), och alla analyser utfördes före biopsiproceduren. Helmuns mätningar och mätningarna av de relevanta tänderna registrerades separat. CAL mättes från cement-emaljövergången till botten av den periodontala fickan och Williams typ av periodontal sond användes för mätningar (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). PI- och GI-mätningar utfördes via en utforskare (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Alla analyser utfördes från sex punkter, tre från buckal aspekt och tre från den palatala aspekten som mesiala, mellersta och distala platser för båda tänderna. Ett medelvärde av sex mätningar registrerades.

Samling av tandköttsprover Gingivalbiopsier erhölls enligt ett protokoll från en tidigare studie [22]. Två gingivalbiopsier erhölls från varje deltagare. Gingivalprovtagning hos parodontalt friska individer utfördes genom kronförlängningsprocedur i rutinbehandlingsprotokollet eller före ortodontiskt indikerad tandutdragning. I parodontitgrupperna erhölls biopsier från den inflammerade tandköttsvävnaden med mindre kirurgiska parodontala ingrepp. Alla biopsier erhölls från bakre maxillära tänder (tand #4, #5, #6 eller #7).

Först utfördes lokalbedövning och ett tandköttsprov dissekerades med en vävnadssax från ett område som kräver antingen gingivektomi/kronförlängning från patienter med nedsatt tandköttstopografi eller före tandutdragning indicerat för ortodontisk behandling hos friska individer. När det gäller parodontitpatienterna dissekerades ett tandköttsprov med hjälp av en vävnadssax under fjällnings- och rotplaneringsproceduren från tandköttsområdena med svår gingivalinflammation. Ett tandköttsprov från varje deltagare placerades omedelbart i 10 % neutralt buffrat formalin under 48 timmar och genomgick histologisk vävnadsbearbetning. De andra proverna från varje deltagare frystes omedelbart vid -80⁰C fram till analysdagen.

Histopatologisk utvärdering Alla histologiska procedurer utfördes av en erfaren blindad forskare (F.G.). Gingivalprover som genomgick histologisk vävnadsbearbetning tvättades först och renades från formalin och torkades med alkoholserier. Sedan rensades alla vävnader med xylen och bäddades in i paraffinblock. Varje block var genomgående sektionerat som seriesnitt och tre sektioner från varje block valdes ut för Hematoxylin-eosin (H&E)-färgning. Fibroblast- och inflammatorisk cellinfiltration utvärderades från H&E-färgade objektglas under 1000x förstoring via ett ljusmikroskop.

För utvärdering av fibroblaster och inflammatoriska celler utvärderades tandköttsområdet vid bindvävsgränsen intill tandköttsepitelet. En cellräkningsram med 10 000 µm2 area valdes under 1000x förstoring. Det totala antalet inflammatoriska celler (neutrofil-, lymfocyt-, eosinofil- och makrofagceller) inom ramen räknades som inflammatorisk cellräkning. Fibroblasterna räknades också på samma sätt. Mätningarna utfördes från tre olika punkter och medelvärdet av dessa tre mätningar registrerades [23].

PPAR-γ, RXR-α och VDR immunhistokemi Immunhistokemi utfördes som rapporterats i tidigare studier [23-26]. Tre sektioner valdes för varje immunhistokemifärgning från varje deltagare. Först avparaffinerades alla objektglas och dehydrerades med alkoholserier. Efter tvättning med destillerat vatten utfördes antigenåtervinning via natriumcitratbuffert (pH 6,0) under två timmar vid 70°C, och sedan undertrycktes endogen peroxidasaktivitet med 3% väteperoxidbehandling. Efter väteperoxidbehandling inkuberades alla objektglas med normalt kaninserum under 30 min. Efter normal seruminkubation bereddes primära antikroppsspädningsmedel och applicerades på proverna över natten i en fuktad kammare vid 4°C. De primära antikropparna var get polyklonal anti-PPAR-y antikropp (1:250), anti-RXR-a antikropp (1:250) och anti-VDR antikropp (1:250). Efter primär antikroppsinkubation tvättades alla objektglas med fosfatbuffertlösning (PBS) tre gånger under fem minuter (3x5) och biotinylerat immunglobulin G applicerades i 30 minuter. Återigen en tvätt av 3x5 PBS, alla prover exponerades för ett streptavidin-pepparrotsperoxidas-konjugerat reagens under ytterligare 30 minuter. Efter tvättning med 3x5 PBS behandlades alla sektioner med AEC-kromogen för att visualisera färgning. Motfärgning utfördes med Meyers hematoxylin och sektioner monterades. Efter att ha låtit torka i två dagar undersöktes proverna under 400x förstoring med hjälp av ljusmikroskopi [23, 24].

Immunhistokemisk semikvantitativ H SCORE-analys Immunhistokemisk utvärdering utfördes på tre olika områden i varje sektion och tre sektioner utvärderades för varje patient. Nio mätningar gjordes för varje deltagare. Alla celler markerades enligt deras färgning som ingen färgning '0', låg färgning '1', mild färgning '2' och tät färgning '3'. Färgningspoäng omvandlades till ett numeriskt värde som "H-poäng" genom en formel (∑Pi(i+l)) som är ett ofta använt värde för immunhistokemi [23, 24]. I den här formeln visar i färgningsintensitetspoängen och Pi: anger procentandelen av de färgade cellerna.

RT-PCR-analys Primrarna som ska användas för generna visades i tabell 1. RNA-isolering och RT-PCR-analys utförs enligt en tidigare studie [27]. Kortfattat, för RT-PCR-analys, homogeniserades första gingivalvävnader och utsattes för sonikering för att avslöja RNA i vävnaderna och vävnadssupernatanter erhölls. Sedan underkastades supernatanterna det totala mRNA-isoleringssteget. Vävnaderna behandlade med Qiazole fick sedan inkuberas i shakern i 5 minuter. Vid slutet av 5 minuter sattes kloroform till mediet innehållande cellerna och inkubationen fortsatte under 3 minuter vid rumstemperatur och sedan centrifugerades proverna. Vid slutet av centrifugen överfördes supernatanten på toppen av röret till ett annat rör. Därefter sattes isopropanol till supernatanten och inkuberades i 10 minuter vid rumstemperatur, och centrifugeringssteget upprepades. Vid slutet av centrifugeringen tvättades pelleten avsatt i botten med 75 % etanol, kvarvarande supernatant centrifugerades igen och suspenderades i rent, sterilt vatten utan RNas. mRNA bestämdes med spektrofotometrisk metod. Med hjälp av qRT-PCR-kitet transformerades sedan en µg mRNA till enstegs-cDNA med användning av specifika primrar riktade mot genen av intresse, senare identifierades generna med hjälp av qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Resultaten normaliserades till p-aktinkontrollgenen.

Statistisk analys Studiens kraft var över 85 % baserat på en tidigare studie med liknande studiedesign [25]. IBM SPSS-programvara användes för statistisk analys. Ett prov K-S-test användes för att testa normaliteten. För antalet fibroblastceller, antal inflammatoriska celler och CAL används One Way ANOVA följt av Tukey-test. För andra parametrar användes Mann Whitney U och Kruskal Wallis tester. Data presenterades som medelvärde ± SD eller procentandel som lämpligt. p < 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta.