Экспрессия PPAR, RXR и VDR при диабете

Настоящий протокол исследования был одобрен этическим комитетом Комитета по медицинской этике Университета Токат Газиосманпаша. Исследование было разработано как перекрестное клиническое исследование и проводилось на факультете стоматологии Университета Токат Газиосманпаша, кафедре пародонтологии. От всех участников было получено информированное согласие, и опытный клиницист (H.B.Y.) провел подробное устное и рентгенологическое обследование.

В исследование были включены 42 участника, по 14 участников в каждой группе. Исследовательские группы были следующими.

Здоровые контроли (C, средний возраст 41,05±1,80, 7 мужчин, 7 женщин) Больные пародонтитом 3 стадии B, (P, средний возраст 42,35±1,92, 7 мужчин, 7 женщин) Больные сахарным диабетом и пародонтитом 3 степени С, (ДП, средний возраст 41,09±1,28, семь мужчин, семь женщин)

Все пациенты и здоровые люди прошли детальное обследование полости рта, и диагноз здоровья пародонта и пародонтита был основан на критериях, определенных недавней классификацией здоровья и заболеваний пародонта в 2017 году на Международном всемирном семинаре по классификации заболеваний и состояний пародонта [21]. .

Все участники никогда не были курильщиками. Критериями исключения были состояния, которые могли повлиять на воспалительное состояние, наличие менее десяти или более отсутствующих зубов, употребление табака или любых наркотиков, наличие беременности или кормления грудью, а также наличие антибиотиков или пародонтальной терапии в течение предыдущих шести месяцев. У пациентов с диабетом в настоящем исследовании значения HbA1c превышали 7,0, даже несмотря на то, что они находились на лечении диабета. А пациенты с диабетом, у которых значения HbA1c были ниже 7,0, не были включены.

Клинические измерения Клиническими параметрами были индекс зубного налета (PI), индекс десны (GI) и уровни клинического прикрепления (CAL), и все анализы проводились до процедуры биопсии. Измерения всего рта и измерения соответствующих зубов регистрировались отдельно. CAL измеряли от цементно-эмалевой границы до дна пародонтального кармана, для измерений использовали пародонтальный зонд типа Вильямса (Hu-Friedy Co., Чикаго, Иллинойс, США). Измерения PI и GI проводились с помощью проводника (Hu-Friedy Co., Чикаго, Иллинойс, США). Все анализы проводились с шести точек, трех со щечной стороны и трех с небной стороны, в качестве мезиальной, средней и дистальной точек для обоих зубов. Регистрировали среднее значение шести измерений.

Сбор образцов десны Биопсия десны была получена в соответствии с протоколом предыдущего исследования [22]. У каждого участника были взяты две биопсии десны. Образцы десны у здоровых пародонтологов выполняли во время процедуры удлинения коронки в рамках стандартного протокола лечения или перед ортодонтически показанным удалением зуба. В группах пародонтита биопсии были получены из воспаленной десневой ткани с незначительными хирургическими вмешательствами на пародонте. Все биопсии были получены из задних зубов верхней челюсти (зуб № 4, № 5, № 6 или № 7).

Во-первых, проводилась местная анестезия, и образец десны иссекался ножницами для ткани из области, требующей либо гингивэктомии/удлинения коронки у пациентов с нарушением топографии десны, либо перед удалением зуба, показанного для ортодонтического лечения у здоровых людей. Что касается пациентов с пародонтитом, образец десны был иссечен с помощью тканевых ножниц во время процедуры удаления зубного камня и планирования корня из участков десны с тяжелым воспалением десны. Один образец десны от каждого участника был немедленно помещен в 10% нейтральный забуференный формалин на 48 часов и подвергнут гистологической обработке ткани. Остальные образцы каждого участника были немедленно заморожены при -80⁰C до дня анализа.

Гистопатологическая оценка Все гистологические процедуры были выполнены опытным слепым исследователем (F.G.). Образцы десны, подвергшиеся гистологической обработке ткани, предварительно промывали и очищали от формалина и обезвоживали серией спиртов. Затем все ткани очищали ксилолом и заливали в парафиновые блоки. Каждый блок был разделен на последовательные срезы, и три среза из каждого блока были выбраны для окрашивания гематоксилин-эозином (H&E). Инфильтрацию фибробластов и воспалительных клеток оценивали на предметных стеклах, окрашенных гематоксилин-эозином, под 1000-кратным увеличением с помощью светового микроскопа.

Для оценки фибробластов и воспалительных клеток оценивали область десны на границе соединительной ткани, соседствующей с эпителием десны. Рамку для подсчета клеток площадью 10 000 мкм2 выбирали при 1000-кратном увеличении. Общее количество воспалительных клеток (нейтрофилы, лимфоциты, эозинофилы и макрофаги) в пределах рамки подсчитывали как подсчет воспалительных клеток. Таким же образом подсчитывали и фибробласты. Измерения проводились в трех разных точках, и регистрировалось среднее значение этих трех измерений [23].

PPAR-γ, RXR-α и VDR Иммуногистохимия Иммуногистохимию проводили, как сообщалось в предыдущих исследованиях [23-26]. Для каждого иммуногистохимического окрашивания от каждого участника отбирали три среза. Во-первых, все слайды были депарафинированы и обезвожены серией спиртов. После промывания дистиллированной водой проводили выделение антигена с помощью цитратно-натриевого буфера (рН 6,0) в течение двух часов при 70°С, а затем активность эндогенной пероксидазы подавляли обработкой 3% перекисью водорода. После обработки перекисью водорода все предметные стекла инкубировали с нормальной кроличьей сывороткой в ​​течение 30 мин. После нормальной инкубации сыворотки готовили первичные разбавители антител и наносили на образцы в течение ночи во влажной камере при 4⁰C. Первичными антителами были козьи поликлональные антитела против PPAR-γ (1:250), антитела против RXR-α (1:250) и антитела против VDR (1:250). После инкубации с первичными антителами все предметные стекла промывали фосфатным буферным раствором (PBS) три раза по пять минут (3x5) и наносили биотинилированный иммуноглобулин G на 30 минут. Снова промывали 3×5 PBS, все образцы подвергали воздействию реагента, конъюгированного со стрептавидином и пероксидазой хрена, в течение еще 30 мин. После промывки 3×5 PBS все срезы обрабатывали хромогеном AEC для визуализации окрашивания. Контрастное окрашивание проводили гематоксилином Мейера и монтировали срезы. После просушки в течение двух суток образцы исследовали под 400-кратным увеличением с помощью световой микроскопии [23, 24].

Иммуногистохимический полуколичественный анализ H SCORE Иммуногистохимическую оценку проводили на трех разных участках в каждом срезе, и у каждого пациента оценивали три среза. Для каждого участника было выполнено девять измерений. Все клетки были отмечены в соответствии с их окрашиванием как отсутствие окрашивания «0», слабое окрашивание «1», слабое окрашивание «2» и плотное окрашивание «3». Показатели окрашивания были преобразованы в числовое значение как «показатель H» по формуле (∑Pi(i+l)), которая часто используется для иммуногистохимии [23, 24]. В этой формуле i показывает показатель интенсивности окрашивания, а Pi: указывает процент окрашенных клеток.

Анализ ОТ-ПЦР. Праймеры, используемые для генов, показаны в таблице 1. Выделение РНК и анализ ОТ-ПЦР проводили согласно предыдущему исследованию [27]. Вкратце, для анализа ОТ-ПЦР сначала ткани десны гомогенизировали и подвергали обработке ультразвуком для выявления РНК в тканях, и получали супернатанты тканей. Затем супернатанты подвергали этапу выделения тотальной мРНК. Ткани, обработанные Qiazole, затем оставляют инкубироваться на шейкере в течение 5 минут. По истечении 5 минут к среде, содержащей клетки, добавляли хлороформ и продолжали инкубацию в течение 3 минут при комнатной температуре, а затем образцы центрифугировали. В конце центрифугирования супернатант с верхней части пробирки переносят в другую пробирку. После этого к супернатанту добавляли изопропанол и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего повторяли стадию центрифугирования. По окончании центрифугирования осевший на дне осадок промывали 75%-ным этанолом, оставшийся супернатант повторно центрифугировали и суспендировали в чистой стерильной воде без РНКазы. мРНК определяли спектрофотометрическим методом. Затем с помощью набора qRT-PCR 1 мкг мРНК трансформировали в одностадийную кДНК с использованием специфических праймеров, нацеленных на интересующий ген, затем гены идентифицировали с помощью qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). . Результаты нормализовали по контрольному гену β-актина.

Статистический анализ Мощность исследования составила более 85% на основе предыдущего исследования с аналогичным дизайном исследования [25]. Программное обеспечение IBM SPSS использовалось для статистического анализа. Для проверки нормальности использовали один образец теста K-S. Для подсчета клеток фибробластов, подсчета воспалительных клеток и CAL использовали однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки. Для других параметров использовались тесты Манна-Уитни U и Крускала-Уоллиса. Данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение или в процентах, в зависимости от обстоятельств. p < 0,05 считались статистически значимыми.