당뇨병에서 PPAR, RXR 및 VDR 발현

본 연구 프로토콜은 Tokat Gaziosmanpasa 대학의 의료 윤리 위원회 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구는 횡단면 임상 연구로 설계되었으며 Tokat Gaziosmanpaşa 대학 치과대학 치주학과에서 수행되었습니다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었고 경험이 풍부한 임상의 (H.B.Y.)가 자세한 구강 및 방사선 검사를 수행했습니다.

각 그룹당 14명씩 총 42명의 참가자가 연구에 등록되었습니다. 스터디 그룹은 다음과 같다.

건강한 대조군(C, 평균 연령 41.05±1.80, 남자 7명, 여자 7명) B등급 3기 치주염 환자, (P, 평균연령 42.35±1.92, 남자 7명, 여자 7명) C등급 3기 당뇨병 및 치주염 환자(DP, 평균연령 41.09±1.28, 남자 일곱, 여자 일곱)

모든 환자와 건강한 개인은 정밀한 구강검진을 받았고, 치주질환과 상태의 분류를 위한 2017년 국제세계워크숍[21] .

모든 참가자는 흡연자가 아니었습니다. 제외 기준은 염증 상태에 영향을 줄 수 있는 조건, 10개 미만 또는 그 이상의 결손, 담배 또는 약물 사용, 임신 또는 수유, 이전 6개월 이내에 항생제 또는 치주 요법의 존재였습니다. 본 연구에서 당뇨병 환자는 당뇨병 치료를 받고 있음에도 불구하고 HbA1c 값이 7.0 이상이었다. 그리고 HbA1c 값이 7.0 미만인 당뇨병 환자는 포함되지 않았습니다.

임상 측정 임상 변수는 플라크 지수(PI), 치은 지수(GI) 및 임상 부착 수준(CAL)이었으며 모든 분석은 생검 절차 전에 수행되었습니다. 입 전체 측정과 해당 치아의 측정을 별도로 기록했습니다. CAL은 시멘트-에나멜 접합부에서 치주낭 바닥까지 측정하였으며 측정에는 Williams's type periodontal probe(Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA)를 사용하였다. PI 및 GI 측정은 탐색기(Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA)를 통해 수행되었습니다. 모든 분석은 양 치아의 근심, 중간, 원위 부위로 협측 3개, 구개측 3개 총 6개 지점에서 시행하였다. 6회 측정의 평균값이 기록되었습니다.

치은 샘플 수집 치은 생검은 이전 연구[22]의 프로토콜에 따라 얻었습니다. 각 참여자로부터 2개의 치은 생검을 얻었다. 치주적으로 건강한 개인의 치은 샘플링은 일상적인 치료 프로토콜에서 또는 치열 교정 지시 발치 전에 치관 연장 절차에 의해 수행되었습니다. 치주염 그룹에서, 작은 외과적 치주 시술로 염증이 생긴 치은 조직으로부터 생검을 얻었다. 모든 생검은 상악 구치부(치아 #4, #5, #6 또는 #7)에서 얻었습니다.

먼저, 국소 마취를 시행하고, 건강한 사람에서 교정 치료를 위해 지시된 발치 전에 또는 치은 지형이 손상된 환자로부터 치은 절제/크라운 연장 절차가 필요한 부위에서 조직 가위로 치은 샘플을 해부하였다. 치주염 환자의 경우 치은 염증이 심한 치은 부위에서 스케일링 및 치근 계획술 시 조직 가위를 이용하여 치은 검체를 절개하였다. 각 참가자의 치은 샘플 하나를 즉시 48시간 동안 10% 중성 완충 포르말린에 넣고 조직학적 조직 처리를 거쳤습니다. 각 참가자의 다른 샘플은 분석 당일까지 즉시 -80⁰C에서 동결되었습니다.

조직병리학적 평가 모든 조직학적 절차는 숙련된 눈가림 연구원(F.G.)에 의해 수행되었습니다. 조직학적 조직 처리를 거친 치은 샘플을 먼저 세척하고 포르말린으로 세척한 후 알코올 계열로 탈수하였다. 그런 다음 모든 조직을 크실렌으로 제거하고 파라핀 블록에 포매했습니다. 연속 섹션으로 섹션화된 각 블록과 각 블록의 세 섹션은 Hematoxylin-eosin(H&E) 염색을 위해 선택되었습니다. 광학 현미경을 통해 1000x 배율 하에서 H&E 염색된 슬라이드로부터 섬유아세포 및 염증 세포 침윤을 평가하였다.

섬유아세포 및 염증 세포 평가를 위해 치은 상피에 인접한 결합 조직 경계의 치은 부위를 평가하였다. 1000x 배율에서 10.000 µm2 영역의 세포 계수 프레임을 선택했습니다. 프레임 내의 총 염증 세포(호중구, 림프구, 호산구 및 대식세포)를 염증 세포 계수로서 계수하였다. 섬유모세포도 마찬가지로 계수하였다. 측정은 서로 다른 세 지점에서 수행되었으며 이 세 측정의 평균을 기록했습니다[23].

PPAR-γ, RXR-α 및 VDR 면역조직화학 면역조직화학은 이전 연구[23-26]에서 보고된 대로 수행되었습니다. 각 참가자의 각 면역조직화학 염색에 대해 3개의 섹션을 선택했습니다. 먼저, 모든 슬라이드를 탈파라핀 처리하고 알코올 계열로 탈수하였다. 증류수로 세척한 후 70°C에서 2시간 동안 구연산나트륨 완충액(pH 6.0)을 통해 항원 검색을 수행한 다음 3% 과산화수소 처리로 내인성 과산화효소 활성을 억제했습니다. 과산화수소 처리 후 모든 슬라이드를 일반 토끼 혈청과 함께 30분 동안 배양하였다. 정상적인 혈청 배양 후, 1차 항체 희석제를 준비하고 4⁰C의 가습 챔버에서 밤새 샘플에 적용했습니다. 1차 항체는 염소 다클론 항-PPAR-γ 항체(1:250), 항-RXR-α 항체(1:250) 및 항-VDR 항체(1:250)였습니다. 1차 항체 배양 후, 모든 슬라이드를 인산염 완충 용액(PBS)으로 5분 동안 3회(3x5) 세척하고 비오티닐화된 면역글로불린 G를 30분 동안 적용하였다. 다시 3x5 PBS로 세척하고 모든 샘플을 streptavidin-horseradish peroxidase-conjugated 시약에 추가로 30분 동안 노출시켰습니다. 3x5 PBS로 세척한 후 모든 섹션을 AEC 크로모겐으로 처리하여 염색을 시각화했습니다. Meyer's hematoxylin으로 대조염색을 수행하고 절편을 장착했습니다. 2일 동안 건조시킨 후 샘플을 광학 현미경 [23, 24]을 사용하여 400x 배율로 검사했습니다.

면역조직화학적 반정량적 H SCORE 분석 면역조직화학 평가는 각 섹션의 세 가지 영역에 대해 수행되었으며, 세 섹션은 각 환자에 대해 평가되었습니다. 각 참가자에 대해 9개의 측정이 수행되었습니다. 모든 세포는 그들의 염색에 따라 염색 없음 '0', 낮은 염색 '1', 약한 염색 '2' 및 조밀한 염색 '3'으로 표시하였다. 염색 점수는 면역조직화학에서 자주 사용되는 값인 (∑Pi(i+l)) 공식을 통해 'H 점수'라는 수치로 환산하였다[23, 24]. 이 공식에서 i는 염색 강도 점수를 나타내고 Pi:는 염색된 세포의 백분율을 나타냅니다.

RT-PCR 분석 유전자에 사용되는 프라이머는 표 1과 같다. 이전 연구[27]에 따라 수행된 RNA 분리 및 RT-PCR 분석. 간략하게, RT-PCR 분석을 위해, 첫 번째 치은 조직을 균질화하고 초음파 처리하여 조직에서 RNA를 드러내고 조직 상청액을 얻었다. 그런 다음 상청액을 전체 mRNA 분리 단계에 적용했습니다. 조직을 Qiazole로 처리한 다음 진탕기에서 5분 동안 배양합니다. 5분이 지난 후, 세포를 포함하는 배지에 클로로포름을 첨가하고 실온에서 3분 동안 배양을 계속한 다음 샘플을 원심분리하였다. 원심분리기가 끝나면 튜브 상단의 상층액을 다른 튜브로 옮겼다. 이후 상등액에 이소프로판올을 첨가하고 상온에서 10분간 배양한 후 원심분리 과정을 반복하였다. 원심분리가 끝나면 바닥에 침전된 펠렛을 75% 에탄올로 세척하고 남은 상층액을 다시 원심분리하여 RNase가 없는 순수한 멸균수에 현탁시켰다. mRNA는 분광광도법으로 측정하였다. 그런 다음 qRT-PCR 키트를 사용하여 관심 유전자를 표적으로 하는 특정 프라이머를 사용하여 1 μg mRNA를 단일 단계 cDNA로 변환하고 나중에 qRT-PCR(Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)의 도움으로 유전자를 확인했습니다. . 결과는 β-actin 제어 유전자로 정규화되었습니다.

통계 분석 유사한 연구 디자인을 가진 이전 연구를 기반으로 연구의 힘은 85% 이상이었습니다 [25]. IBM SPSS 소프트웨어는 통계 분석에 사용되었습니다. 하나의 샘플 K-S 테스트가 정규성을 테스트하는 데 사용되었습니다. 섬유아세포 세포 수, 염증 세포 수 및 CAL의 경우 일원 분산 분석에 이어 Tukey 테스트가 사용되었습니다. 다른 매개변수의 경우 Mann Whitney U 및 Kruskal Wallis 테스트가 사용되었습니다. 데이터는 평균 ± SD 또는 적절한 백분율로 표시되었습니다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.