Exprese PPAR, RXR a VDR u diabetu

Tento protokol studie byl schválen etickou komisí Lékařské etické komise Univerzity Tokat Gaziosmanpasa. Studie byla navržena jako průřezová klinická studie a byla provedena na Tokat Gaziosmanpaşa University Fakultě zubního lékařství Ústav parodontologie. Od všech účastníků byl získán informovaný souhlas a podrobné ústní a radiologické vyšetření bylo provedeno zkušeným klinikem (H.B.Y.).

Do studie bylo zařazeno 42 účastníků, 14 účastníků v každé skupině. Studijní skupiny byly následující.

Zdravé kontroly (C, průměrný věk 41,05±1,80, sedm mužů, sedm žen) pacienti s parodontózou ve stadiu 3 stupně B, (P, průměrný věk 42,35±1,92, sedm mužů, sedm žen) Pacienti s diabetem a parodontitidou ve stadiu 3 stupně C, (DP, průměrný věk 41,09±1,28, sedm mužů, sedm žen)

Všichni pacienti a zdraví jedinci prošli podrobným orálním vyšetřením a diagnostika parodontitidy a parodontitidy byla založena na kritériích definovaných nedávnou klasifikací parodontálního zdraví a nemocí v roce 2017 na Mezinárodním světovém workshopu pro klasifikaci parodontálních nemocí a stavů [21]. .

Všichni účastníci nebyli nikdy kuřáci. Vylučovacími kritérii byly stavy, které by mohly ovlivnit zánětlivý stav, existence méně než deseti nebo více chybějících zubů, užívání tabáku nebo jakékoli drogy, přítomnost těhotenství nebo kojení a existence antibiotické nebo periodontální terapie během předchozích šesti měsíců. Pacienti s diabetem v této studii měli hodnoty HbA1c vyšší než 7,0, i když byli léčeni diabetem. A diabetici, kteří měli hodnoty HbA1c pod 7,0, nebyli zahrnuti.

Klinická měření Klinické parametry byly index plaku (PI), gingivální index (GI) a úrovně klinického připojení (CAL) a všechny analýzy byly provedeny před biopsií. Odděleně byla zaznamenávána měření plných úst a měření příslušných zubů. CAL byla měřena od spojení cement-smalt ke dnu periodontální kapsy a pro měření byla použita periodontální sonda Williamsova typu (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Měření PI a GI byla provedena pomocí průzkumníka (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Všechny analýzy byly provedeny ze šesti bodů, tři z bukálního aspektu a tři z patrového aspektu jako meziální, střední a distální místa pro oba zuby. Byla zaznamenána střední hodnota ze šesti měření.

Odběr gingiválních vzorků Gingivální biopsie byly získány podle protokolu z předchozí studie [22]. Od každého účastníka byly získány dvě gingivální biopsie. Odběr vzorků z gingivy u periodontálně zdravých jedinců byl proveden procedurou prodlužování korunky v rutinním léčebném protokolu nebo před ortodonticky indikovanou extrakcí zubu. Ve skupinách s parodontitidou byly biopsie získány ze zanícené gingivální tkáně drobnými chirurgickými parodontálními výkony. Všechny biopsie byly získány ze zadních maxilárních zubů (zub #4, #5, #6 nebo #7).

Nejprve byla provedena lokální anestezie a gingivální vzorek byl vypreparován tkáňovými nůžkami z oblasti vyžadující buď gingivektomii/prodloužení korunky u pacientů s poškozenou gingivální topografií nebo před extrakcí zubu indikovanou k ortodontické léčbě u zdravých jedinců. U pacientů s parodontitidou byl vzorek dásně vypreparován pomocí tkáňových nůžek během procedury škálování a plánování kořenů z gingiválních oblastí se závažným zánětem dásní. Jeden gingivální vzorek od každého účastníka byl okamžitě umístěn do 10% neutrálního pufrovaného formalínu na 48 hodin a podstoupil histologické zpracování tkáně. Ostatní vzorky každého účastníka byly okamžitě zmraženy na -80 °C až do dne analýzy.

Histopatologické hodnocení Všechny histologické postupy byly provedeny zkušeným zaslepeným výzkumníkem (F.G.). Gingivální vzorky, které prošly histologickým zpracováním tkáně, byly nejprve omyty a očištěny od formalínu a byly dehydratovány alkoholovou sérií. Poté byly všechny tkáně vyčištěny xylenem a uloženy do parafinových bloků. Každý blok rozřezaný jako sériové řezy a tři řezy z každého bloku byly vybrány pro barvení hematoxylinem-eosinem (H&E). Fibroblasty a infiltrace zánětlivých buněk byly hodnoceny ze sklíček obarvených H&E při 1000násobném zvětšení pomocí světelného mikroskopu.

Pro hodnocení fibroblastů a zánětlivých buněk byla hodnocena gingivální oblast na hranici pojivové tkáně sousedící s gingiválním epitelem. Byl vybrán rámec pro počítání buněk o ploše 10 000 um2 při 1000x zvětšení. Celkové zánětlivé buňky (neutrofily, lymfocyty, eosinofily a makrofágové buňky) v rámci byly počítány jako počítání zánětlivých buněk. Fibroblasty byly také počítány podobně. Měření byla provedena ze tří různých bodů a byl zaznamenán průměr těchto tří měření [23].

Imunohistochemie PPAR-γ, RXR-α a VDR Imunohistochemie byla provedena tak, jak bylo popsáno v předchozích studiích [23-26]. Pro každé imunohistochemické barvení od každého účastníka byly vybrány tři řezy. Nejprve byla všechna sklíčka zbavena parafinu a dehydratována sérií alkoholu. Po promytí destilovanou vodou bylo získávání antigenu provedeno pomocí pufru citrátu sodného (pH 6,0) po dobu dvou hodin při teplotě 70 °C a poté byla aktivita endogenní peroxidázy potlačena působením 3% peroxidu vodíku. Po ošetření peroxidem vodíku byla všechna sklíčka inkubována s normálním králičím sérem po dobu 30 minut. Po normální inkubaci séra byla připravena primární ředidla protilátek a aplikována na vzorky přes noc ve zvlhčené komoře při 4 °C. Primárními protilátkami byly kozí polyklonální anti-PPAR-y protilátka (1:250), anti-RXR-a protilátka (1:250) a anti-VDR protilátka (1:250). Po inkubaci primární protilátky byla všechna sklíčka promyta roztokem fosfátového pufru (PBS) třikrát po dobu pěti minut (3x5) a na 30 minut byl aplikován biotinylovaný imunoglobulin G. Opět promytí 3x5 PBS, všechny vzorky byly vystaveny činidlu konjugovanému se streptavidinem a křenovou peroxidázou po dobu dalších 30 minut. Po promytí 3x5 PBS byly všechny řezy ošetřeny AEC chromogenem pro vizualizaci barvení. Kontrastní barvení bylo provedeno Meyerovým hematoxylinem a byly namontovány řezy. Po dvou dnech schnutí byly vzorky zkoumány pod 400násobným zvětšením pomocí světelné mikroskopie [23, 24].

Imunohistochemická semikvantitativní analýza H SCORE Imunohistochemické hodnocení bylo provedeno na třech různých oblastech v každém řezu a u každého pacienta byly hodnoceny tři řezy. Pro každého účastníka bylo provedeno devět měření. Všechny buňky byly označeny podle jejich barvení jako žádné barvení '0', nízké barvení '1', mírné barvení '2' a husté barvení '3'. Skóre barvení bylo převedeno na číselnou hodnotu jako „H skóre“ pomocí vzorce (∑Pi(i+l)), což je často používaná hodnota pro imunohistochemii [23, 24]. V tomto vzorci i ukazuje skóre intenzity barvení a Pi: označuje procento obarvených buněk.

Analýza RT-PCR Primery, které mají být použity pro geny, jsou uvedeny v tabulce 1. Izolace RNA a analýza RT-PCR byly provedeny podle předchozí studie [27]. Stručně řečeno, pro analýzu RT-PCR byly nejprve gingivální tkáně homogenizovány a podrobeny sonikaci za účelem odhalení RNA ve tkáních a byly získány tkáňové supernatanty. Poté byly supernatanty podrobeny kroku izolace celkové mRNA. Tkáně ošetřené Qiazolem se poté nechaly inkubovat v třepačce po dobu 5 minut. Na konci 5 minut byl k médiu obsahujícímu buňky přidán chloroform a inkubace pokračovala 3 minuty při teplotě místnosti a poté byly vzorky odstředěny. Na konci centrifugy se supernatant v horní části zkumavky přenesl do jiné zkumavky. Poté byl k supernatantu přidán isopropanol a inkubován po dobu 10 minut při teplotě místnosti a krok centrifugace byl opakován. Na konci centrifugace byla peleta usazená na dně promyta 75% ethanolem, zbývající supernatant byl znovu centrifugován a suspendován v čisté sterilní vodě bez RNázy. mRNA byly stanoveny spektrofotometrickou metodou. Poté pomocí soupravy qRT-PCR byl jeden µg mRNA transformován do jednokrokové cDNA pomocí specifických primerů cílených na požadovaný gen, později byly geny identifikovány pomocí qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Výsledky byly normalizovány na kontrolní gen β-aktinu.

Statistická analýza Síla studie byla více než 85 % na základě předchozí studie s podobným designem studie [25]. Pro statistickou analýzu byl použit software IBM SPSS. K testování normality byl použit jeden vzorek K-S test. Pro počty fibroblastových buněk, počty zánětlivých buněk a CAL byl použit One Way ANOVA následovaný Tukey testem. Pro ostatní parametry byly použity testy Mann Whitney U a Kruskal Wallis. Data byla prezentována jako průměr ± SD nebo procento podle potřeby. p < 0,05 byly považovány za statisticky významné.