Expresiones de PPAR, RXR y VDR en diabetes

El presente protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética del Comité de Ética Médica de la Universidad Tokat Gaziosmanpasa. El estudio se diseñó como un estudio clínico transversal y se llevó a cabo en el Departamento de Periodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad Tokat Gaziosmanpaşa. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes, y un médico experimentado (H.B.Y.) realizó un examen oral y radiológico detallado.

Cuarenta y dos participantes, 14 participantes en cada grupo, se inscribieron en el estudio. Los grupos de estudio fueron los siguientes.

Controles sanos (C, edad media 41,05±1,80, siete hombres, siete mujeres) Pacientes con periodontitis en estadio 3 grado B, (P, edad media 42,35±1,92, siete hombres, siete mujeres) Pacientes con diabetes y periodontitis con estadio 3 grado C, (DP, edad media 41,09±1,28, siete hombres, siete mujeres)

Todos los pacientes y personas sanas se sometieron a un examen oral detallado, y la salud periodontal y el diagnóstico de periodontitis se basaron en los criterios definidos por la clasificación reciente de salud y enfermedades periodontales en el Taller Mundial Internacional para una Clasificación de Enfermedades y Condiciones Periodontales de 2017 [21] .

Todos los participantes nunca fueron fumadores. Los criterios de exclusión fueron condiciones que pudieran afectar el estado inflamatorio, la existencia de menos de diez o más dientes perdidos, el consumo de tabaco o cualquier droga, la presencia de embarazo o lactancia y la existencia de terapia periodontal o antibiótica dentro de los seis meses anteriores. Los pacientes con diabetes en el presente estudio tenían valores de HbA1c superiores a 7,0 a pesar de que estaban bajo tratamiento para diabéticos. Y no se incluyeron los pacientes diabéticos que tenían valores de HbA1c por debajo de 7,0.

Mediciones clínicas Los parámetros clínicos fueron el índice de placa (PI), el índice gingival (GI) y los niveles de inserción clínica (CAL), y todos los análisis se realizaron antes del procedimiento de biopsia. Las medidas de boca completa y las medidas de los dientes relevantes se registraron por separado. El CAL se midió desde la unión cemento-esmalte hasta el fondo de la bolsa periodontal y se utilizó una sonda periodontal tipo Williams para las mediciones (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, EE. UU.). Las mediciones de PI y GI se realizaron a través de un explorador (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, EE. UU.). Todos los análisis se realizaron desde seis puntos, tres desde el aspecto bucal y tres desde el aspecto palatino como sitios mesial, medio y distal para ambos dientes. Se registró un valor medio de seis mediciones.

Recolección de muestras gingivales Se obtuvieron biopsias gingivales según un protocolo de un estudio previo [22]. Se obtuvieron dos biopsias gingivales de cada participante. El muestreo gingival en individuos periodontalmente sanos se realizó mediante procedimiento de alargamiento de corona en el protocolo de tratamiento de rutina o antes de la extracción dental indicada por ortodoncia. En los grupos de periodontitis, se obtuvieron biopsias del tejido gingival inflamado con procedimientos periodontales quirúrgicos menores. Todas las biopsias se obtuvieron de los dientes maxilares posteriores (diente n.° 4, n.° 5, n.° 6 o n.° 7).

En primer lugar, se realizó anestesia local y se diseccionó una muestra gingival con una tijera tisular de un área que requería procedimientos de gingivectomía/alargamiento de corona en pacientes con topografía gingival alterada o antes de la extracción dental indicada para el tratamiento de ortodoncia en individuos sanos. En cuanto a los pacientes con periodontitis, se diseccionó una muestra gingival utilizando una tijera tisular durante el procedimiento de raspado y alisado radicular de las áreas gingivales con inflamación gingival severa. Una muestra gingival de cada participante se colocó inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10% durante 48 horas y se sometió a procesamiento histológico del tejido. Las demás muestras de cada participante se congelaron inmediatamente a -80⁰C hasta el día del análisis.

Evaluación histopatológica Todos los procedimientos histológicos fueron realizados por un investigador ciego experimentado (F.G.). Las muestras gingivales que se sometieron al procesamiento histológico del tejido primero se lavaron y limpiaron de formalina y se deshidrataron con series de alcohol. Luego, todos los tejidos se aclararon con xileno y se incluyeron en bloques de parafina. Cada bloque se seccionó completamente como secciones en serie y se seleccionaron tres secciones de cada bloque para la tinción con hematoxilina-eosina (H&E). La infiltración de fibroblastos y células inflamatorias se evaluó a partir de portaobjetos teñidos con H&E con un aumento de 1000x a través de un microscopio óptico.

Para la evaluación de fibroblastos y células inflamatorias, se evaluó el área gingival en el borde del tejido conectivo vecino al epitelio gingival. Se seleccionó un marco de recuento de células de 10.000 µm2 de área con un aumento de 1000x. Las células inflamatorias totales (células de neutrófilos, linfocitos, eosinófilos y macrófagos) dentro del marco se contaron como recuento de células inflamatorias. Los fibroblastos también se contaron igualmente. Las mediciones se realizaron desde tres puntos diferentes, y se registró la media de estas tres mediciones [23].

PPAR-γ, RXR-α y VDR Inmunohistoquímica La inmunohistoquímica se realizó como se informó en estudios previos [23-26]. Se eligieron tres secciones para cada tinción inmunohistoquímica de cada participante. En primer lugar, todos los portaobjetos se desparafinizaron y deshidrataron con series de alcohol. Después de lavar con agua destilada, la recuperación del antígeno se realizó a través de un tampón de citrato de sodio (pH 6,0) durante dos horas a 70 °C, y luego se suprimió la actividad de la peroxidasa endógena con un tratamiento con peróxido de hidrógeno al 3%. Después del tratamiento con peróxido de hidrógeno, todos los portaobjetos se incubaron con suero normal de conejo durante 30 min. Después de la incubación normal del suero, se prepararon diluyentes de anticuerpos primarios y se aplicaron a las muestras durante la noche en una cámara humidificada a 4⁰C. Los anticuerpos primarios fueron anticuerpos anti-PPAR-γ policlonales de cabra (1:250), anticuerpos anti-RXR-α (1:250) y anticuerpos anti-VDR (1:250). Después de la incubación del anticuerpo primario, todos los portaobjetos se lavaron con solución tampón de fosfato (PBS) tres veces durante cinco minutos (3x5) y se aplicó inmunoglobulina G biotinilada durante 30 min. De nuevo un lavado de 3x5 PBS, todas las muestras se expusieron a un reactivo conjugado con estreptavidina-peroxidasa de rábano picante durante otros 30 min. Después de lavar con PBS 3x5, todas las secciones se trataron con cromógeno AEC para visualizar la tinción. Se realizó una contratinción con hematoxilina de Meyer y se montaron las secciones. Después de dejar secar durante dos días, las muestras se examinaron con un aumento de 400x usando microscopía óptica [23, 24].

Análisis inmunohistoquímico semicuantitativo H SCORE La evaluación inmunohistoquímica se realizó en tres áreas diferentes en cada sección, y se evaluaron tres secciones para cada paciente. Se realizaron nueve mediciones para cada participante. Todas las células se marcaron según su tinción como sin tinción '0', tinción baja '1', tinción leve '2' y tinción densa '3'. Las puntuaciones de tinción se convirtieron a un valor numérico como "puntuación H" a través de una fórmula (∑Pi(i+l)), que es un valor de uso frecuente para la inmunohistoquímica [23, 24]. En esta fórmula, i muestra la puntuación de intensidad de tinción y Pi: indica el porcentaje de células teñidas.

Análisis RT-PCR Los cebadores que se utilizarán para los genes se muestran en la tabla 1. El aislamiento de ARN y el análisis por RT-PCR se realizaron de acuerdo con un estudio anterior [27]. Brevemente, para el análisis de RT-PCR, primero se homogeneizaron los tejidos gingivales y se sometieron a sonicación para revelar el ARN en los tejidos y se obtuvieron los sobrenadantes de tejido. Luego, los sobrenadantes se sometieron al paso de aislamiento de ARNm total. Los tejidos tratados con Qiazole, luego se dejaron incubar en el agitador durante 5 minutos. Al cabo de 5 minutos, se añadió cloroformo al medio que contenía las células y se continuó la incubación durante 3 minutos a temperatura ambiente y luego se centrifugaron las muestras. Al final de la centrífuga, el sobrenadante en la parte superior del tubo se transfirió a otro tubo. Posteriormente, se añadió isopropanol al sobrenadante, se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente y se repitió el paso de centrifugado. Al final de la centrifugación, el sedimento depositado en el fondo se lavó con etanol al 75%, el sobrenadante remanente se centrifugó nuevamente y se suspendió en agua pura estéril sin ARNasa. Los ARNm se determinaron por método espectrofotométrico. Luego, usando el kit qRT-PCR, se transformó un µg de ARNm en ADNc de un solo paso usando cebadores específicos dirigidos al gen de interés, luego los genes se identificaron con la ayuda de qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) . Los resultados se normalizaron al gen de control de β-actina.

Análisis estadístico La potencia del estudio fue superior al 85 % según un estudio anterior con un diseño de estudio similar [25]. Se utilizó el software IBM SPSS para el análisis estadístico. Se usó una prueba K-S de muestra para probar la normalidad. Para los recuentos de células de fibroblastos, recuentos de células inflamatorias y CAL, se usó ANOVA de una vía seguido de la prueba de Tukey. Para otros parámetros se utilizaron las pruebas U de Mann Whitney y Kruskal Wallis. Los datos se presentaron como media ± DE o porcentaje, según correspondiera. p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.