Ekspresje PPAR, RXR i VDR w cukrzycy

Niniejszy protokół badania został zatwierdzony przez komisję etyczną Komisji Etyki Lekarskiej Uniwersytetu Tokat Gaziosmanpasa. Badanie zostało zaprojektowane jako przekrojowe badanie kliniczne i zostało przeprowadzone na Wydziale Stomatologii Uniwersytetu Tokat Gaziosmanpaşa w Klinice Periodontologii. Od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę, a szczegółowe badanie jamy ustnej i radiologiczne przeprowadził doświadczony klinicysta (H.B.Y.).

W badaniu wzięło udział czterdziestu dwóch uczestników, po 14 uczestników w każdej grupie. Grupy badawcze były następujące.

Zdrowe kontrole (C, średni wiek 41,05 ± 1,80, siedmiu mężczyzn, siedem kobiet) Pacjenci z zapaleniem przyzębia w stopniu 3 stopnia B, (P, średni wiek 42,35±1,92, siedmiu mężczyzn, siedem kobiet) Pacjenci z cukrzycą i zapaleniem przyzębia w stopniu 3 stopnia C, (DP, średni wiek 41,09±1,28, siedmiu mężczyzn, siedem kobiet)

Wszyscy pacjenci i osoby zdrowe przeszli szczegółowe badanie jamy ustnej, a diagnozę stanu przyzębia i zapalenia przyzębia oparto na kryteriach określonych w najnowszej klasyfikacji zdrowia i chorób przyzębia w International World Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Schorzenia z 2017 r. [21] .

Wszyscy uczestnicy nigdy nie palili. Kryteriami wykluczenia były stany, które mogą wpływać na stan zapalny, istnienie mniej niż dziesięciu lub więcej brakujących zębów, używanie tytoniu lub jakichkolwiek narkotyków, obecność ciąży lub laktacji oraz istnienie terapii antybiotykowej lub periodontologicznej w ciągu ostatnich sześciu miesięcy. Pacjenci z cukrzycą w niniejszym badaniu mieli wartości HbA1c większe niż 7,0, mimo że byli leczeni na cukrzycę. A pacjenci z cukrzycą, którzy mieli wartości HbA1c poniżej 7,0, nie zostali uwzględnieni.

Pomiary kliniczne Parametrami klinicznymi były wskaźnik płytki nazębnej (PI), wskaźnik dziąseł (GI) i kliniczny poziom przyczepu (CAL), a wszystkie analizy przeprowadzono przed zabiegiem biopsji. Pomiary pełnych ust i pomiary odpowiednich zębów rejestrowano oddzielnie. CAL mierzono od połączenia cementu ze szkliwem do dna kieszonki przyzębnej, a do pomiarów używano sondy periodontologicznej typu Williamsa (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Pomiary PI i GI przeprowadzono za pomocą eksploratora (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Wszystkie analizy przeprowadzono z sześciu punktów, trzech od strony policzkowej i trzech od strony podniebiennej, jako miejsc mezjalnych, środkowych i dystalnych dla obu zębów. Zarejestrowano średnią wartość z sześciu pomiarów.

Pobieranie próbek dziąseł Biopsje dziąseł uzyskano zgodnie z protokołem z poprzedniego badania [22]. Od każdego uczestnika pobrano dwie biopsje dziąseł. Pobieranie próbek dziąseł u osób zdrowych przyzębia odbywało się poprzez wydłużenie korony w ramach rutynowego protokołu leczenia lub przed ekstrakcją zęba ze wskazań ortodontycznych. W grupach z zapaleniem przyzębia biopsje pobierano z zapalnej tkanki dziąseł po drobnych zabiegach chirurgicznych w obrębie przyzębia. Wszystkie biopsje uzyskano z tylnych zębów szczęki (ząb nr 4, nr 5, nr 6 lub nr 7).

W pierwszej kolejności wykonano znieczulenie miejscowe i wypreparowano nożyczkami tkankowymi wycinek dziąsła z obszaru wymagającego usunięcia dziąsła/wydłużenia korony u pacjentów z upośledzoną topografią dziąsła lub przed ekstrakcją zęba wskazaną do leczenia ortodontycznego u osób zdrowych. Jeśli chodzi o pacjentów z zapaleniem przyzębia, wycięto próbkę dziąsła za pomocą nożyczek do tkanek podczas procedury skalowania i planowania korzenia z obszarów dziąseł z ciężkim zapaleniem dziąseł. Jedna próbka dziąsła od każdego uczestnika została natychmiast umieszczona w 10% obojętnej buforowanej formalinie na 48 godzin i poddana obróbce histologicznej tkanki. Pozostałe próbki każdego uczestnika zostały natychmiast zamrożone w temperaturze -80⁰C do dnia analizy.

Ocena histopatologiczna Wszystkie procedury histologiczne zostały przeprowadzone przez doświadczonego, zaślepionego badacza (F.G.). Próbki dziąseł, które poddano obróbce histologicznej tkanki, najpierw przemyto i oczyszczono z formaliny, a następnie odwodniono serią alkoholową. Następnie wszystkie tkanki oczyszczono ksylenem i zatopiono w bloczkach parafinowych. Każdy blok podzielony na sekcje seryjne i trzy skrawki z każdego bloku wybrano do barwienia hematoksyliną-eozyną (H&E). Naciek fibroblastów i komórek zapalnych oceniano na preparatach barwionych H&E pod 1000-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu świetlnego.

W celu oceny fibroblastów i komórek zapalnych oceniano obszar dziąseł na granicy tkanki łącznej sąsiadujący z nabłonkiem dziąseł. Pod 1000-krotnym powiększeniem wybrano ramkę zliczania komórek o powierzchni 10 000 µm2. Całkowite komórki zapalne (neutrofile, limfocyty, eozynofile i makrofagi) w ramce zliczono jako zliczanie komórek zapalnych. Podobnie zliczono fibroblasty. Pomiary wykonywano z trzech różnych punktów i rejestrowano średnią z tych trzech pomiarów [23].

PPAR-γ, RXR-α i VDR Immunohistochemia Immunohistochemia została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszymi badaniami [23-26]. Wybrano trzy skrawki dla każdego barwienia immunohistochemicznego od każdego uczestnika. Najpierw wszystkie preparaty odparafinowano i odwodniono serią alkoholową. Po przemyciu wodą destylowaną przeprowadzono odzyskiwanie antygenu za pomocą buforu cytrynianu sodu (pH 6,0) przez dwie godziny w temperaturze 70°C, a następnie endogenną aktywność peroksydazy stłumiono przez traktowanie 3% nadtlenkiem wodoru. Po traktowaniu nadtlenkiem wodoru wszystkie szkiełka inkubowano z normalną króliczą surowicą przez 30 minut. Po normalnej inkubacji surowicy przygotowano rozcieńczalniki przeciwciał pierwotnych i nałożono je na próbki przez noc w nawilżanej komorze w temperaturze 4⁰C. Pierwotnymi przeciwciałami były kozie przeciwciało poliklonalne anty-PPAR-γ (1:250), przeciwciało anty-RXR-α (1:250) i przeciwciało anty-VDR (1:250). Po inkubacji pierwotnego przeciwciała, wszystkie szkiełka przemyto trzykrotnie roztworem buforu fosforanowego (PBS) przez pięć minut (3x5) i nałożono biotynylowaną immunoglobulinę G na 30 minut. Ponownie przemywając 3x5 PBS, wszystkie próbki eksponowano na odczynnik sprzężony ze streptawidyną-peroksydazą chrzanową przez kolejne 30 minut. Po przemyciu 3x5 PBS, wszystkie skrawki potraktowano chromogenem AEC w celu uwidocznienia barwienia. Barwienie kontrastujące wykonano hematoksyliną Meyera i skrawki zamontowano. Po pozostawieniu do wyschnięcia na dwa dni próbki zbadano pod 400-krotnym powiększeniem przy użyciu mikroskopu świetlnego [23, 24].

Immunohistochemiczna półilościowa analiza H SCORE Ocenę immunohistochemiczną przeprowadzono na trzech różnych obszarach w każdym skrawku, a dla każdego pacjenta oceniano trzy skrawki. Dla każdego uczestnika wykonano dziewięć pomiarów. Wszystkie komórki oznaczono zgodnie z ich wybarwieniem jako brak wybarwienia „0”, słabe wybarwienie „1”, łagodne wybarwienie „2” i gęste wybarwienie „3”. Wyniki barwienia przeliczono na wartość liczbową jako „wynik H” za pomocą wzoru (∑Pi(i+l)), który jest często używaną wartością w immunohistochemii [23, 24]. W tym wzorze i pokazuje wynik intensywności barwienia, a Pi: wskazuje procent wybarwionych komórek.

Analiza RT-PCR Startery do użycia dla genów przedstawiono w tabeli 1. Izolacja RNA i analiza RT-PCR przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym badaniem [27]. W skrócie, do analizy RT-PCR, pierwsze tkanki dziąseł homogenizowano i poddano sonikacji w celu ujawnienia RNA w tkankach i uzyskano supernatanty tkankowe. Następnie supernatanty poddano etapowi izolacji całkowitego mRNA. Tkanki potraktowano Qiazolem, a następnie pozostawiono do inkubacji w wytrząsarce przez 5 minut. Po upływie 5 minut do pożywki zawierającej komórki dodano chloroform i kontynuowano inkubację przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie próbki odwirowano. Na końcu wirówki supernatant z górnej części probówki przeniesiono do innej probówki. Następnie do supernatantu dodano izopropanol i inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, po czym powtórzono etap wirowania. Pod koniec wirowania osad osadzony na dnie przemyto 75% etanolem, pozostały supernatant ponownie odwirowano i zawieszono w czystej, sterylnej wodzie bez RNaz. mRNA oznaczono metodą spektrofotometryczną. Następnie za pomocą zestawu qRT-PCR jeden µg mRNA transformowano do jednoetapowego cDNA przy użyciu specyficznych starterów ukierunkowanych na interesujący gen, później geny zidentyfikowano za pomocą qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Wyniki normalizowano do genu kontrolnego β-aktyny.

Analiza statystyczna Siła badania wynosiła ponad 85% w oparciu o wcześniejsze badanie o podobnym schemacie badania [25]. Do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie IBM SPSS. Do sprawdzenia normalności zastosowano test K-S jednej próbki. W przypadku liczby komórek fibroblastów, liczby komórek zapalnych i CAL zastosowano jednokierunkową ANOVA, a następnie test Tukeya. Dla pozostałych parametrów zastosowano testy U Manna Whitneya i Kruskala Wallisa. Dane przedstawiono odpowiednio jako średnią ± SD lub procent. p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.