PPAR-, RXR- og VDR-uttrykk ved diabetes

Den nåværende studieprotokollen ble godkjent av den etiske komiteen til den medisinske etiske komiteen ved Tokat Gaziosmanpasa University. Studien ble designet som en tverrsnittsstudie og utført ved Tokat Gaziosmanpaşa University Fakultet for odontologi Institutt for periodontologi. Informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne, og detaljert muntlig og radiologisk undersøkelse ble utført av en erfaren kliniker (H.B.Y.).

42 deltakere, 14 deltakere i hver gruppe, ble registrert i studien. Studiegruppene var som følger.

Friske kontroller (C, gjennomsnittsalder 41,05±1,80, syv menn, syv kvinner) Periodontittpasienter med stadium 3 grad B, (P, gjennomsnittsalder 42,35±1,92, syv menn, syv kvinner) Pasienter med diabetes og periodontitt med stadium 3 grad C, (DP, gjennomsnittsalder 41,09±1,28, syv menn, syv kvinner)

Alle pasienter og friske individer gikk gjennom en detaljert muntlig undersøkelse, og diagnose av periodontal helse og periodontitt var basert på kriteriene definert av den nylige klassifiseringen av periodontal helse og sykdommer i 2017 International World Workshop for a Classification of Periodontal Diseases and Conditions [21] .

Alle deltakerne var aldri røykere. Eksklusjonskriterier var tilstander som kan påvirke den inflammatoriske tilstanden, eksistensen av mindre enn ti eller mer manglende tenner, tobakk eller annen medikamentbruk, tilstedeværelse av graviditet eller amming, og eksistensen av antibiotika eller periodontal terapi i løpet av de siste seks månedene. Diabetespasienter i denne studien hadde HbA1c-verdier høyere enn 7,0 selv om de var under diabetesbehandling. Og diabetespasientene som hadde HbA1c-verdier under 7,0 ble ikke inkludert.

Kliniske målinger Kliniske parametere var plakkindeks (PI), gingivalindeks (GI) og klinisk tilknytningsnivå (CAL), og alle analyser ble utført før biopsiprosedyren. Full munnmålinger og målene av de aktuelle tennene ble registrert separat. CAL ble målt fra sement-emaljekrysset til bunnen av periodontallommen og Williams type periodontalprobe ble brukt til målinger (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). PI- og GI-målinger ble utført via en utforsker (Hu-Friedy Co., Chicago, IL, USA). Alle analyser ble utført fra seks punkter, tre fra bukkal aspekt og tre fra palatale aspekt som mesiale, midtre og distale steder for begge tenner. En middelverdi på seks målinger ble registrert.

Innsamling av gingivalprøver Gingivalbiopsier ble tatt i henhold til en protokoll fra en tidligere studie [22]. To gingivalbiopsier ble tatt fra hver deltaker. Gingivalprøvetaking hos periodontalt friske individer ble utført ved prosedyre for kroneforlengelse i rutinebehandlingsprotokollen eller før kjeveortopedisk indikert tannekstraksjon. I periodontittgruppene ble det tatt biopsier fra det betente gingivalvevet med mindre kirurgiske periodontale inngrep. Alle biopsier ble tatt fra bakre overkjeve tenner (tann #4, #5, #6 eller #7).

Først ble det utført lokalbedøvelse, og en tannkjøttprøve ble dissekert med en vevssaks fra et område som krever enten gingivektomi/kroneforlengende prosedyrer fra pasienter med nedsatt gingivaltopografi eller før tannekstraksjon indisert for kjeveortopedisk behandling hos friske personer. Når det gjelder periodontittpasientene, ble det dissekert en tannkjøttprøve ved hjelp av en vevssaks under skalerings- og rotplanleggingsprosedyren fra gingivalområdene med alvorlig gingivalbetennelse. Én tannkjøttprøve fra hver deltaker ble umiddelbart plassert i 10 % nøytral bufret formalin i 48 timer og gjennomgikk histologisk vevsbehandling. De andre prøvene av hver deltaker ble umiddelbart frosset ved -80⁰C frem til analysedagen.

Histopatologisk evaluering Alle histologiske prosedyrer ble utført av en erfaren blindet forsker (F.G.). Gingivalprøver som gjennomgikk histologisk vevsbehandling ble først vasket og renset for formalin og ble dehydrert med alkoholserier. Deretter ble alt vev renset med xylen og innebygd i parafinblokker. Hver blokk seksjonert gjennom som seriesnitt og tre seksjoner fra hver blokk ble valgt for Hematoxylin-eosin (H&E)-farging. Fibroblast- og inflammatorisk celleinfiltrasjon ble evaluert fra H&E-fargede objektglass under 1000x forstørrelse via et lysmikroskop.

For fibroblast- og inflammatorisk celleevaluering ble tannkjøttområdet ved bindevevsgrensen til naboepitelet for gingival evaluert. En celletellerramme på 10.000 µm2 areal ble valgt under 1000x forstørrelse. De totale betennelsescellene (nøytrofile, lymfocytt-, eosinofile og makrofagceller) innenfor rammen ble regnet som telling av inflammatoriske celler. Fibroblastene ble også talt på samme måte. Målingene ble utført fra tre forskjellige punkter, og gjennomsnittet av disse tre målingene ble registrert [23].

PPAR-γ, RXR-α og VDR immunhistokjemi Immunhistokjemi ble utført som rapportert i tidligere studier [23-26]. Tre seksjoner ble valgt for hver immunhistokjemifarging fra hver deltaker. Først ble alle objektglass avparafinisert og dehydrert med alkoholserier. Etter vasking med destillert vann ble antigeninnhenting utført via natriumsitratbuffer (pH 6,0) i to timer ved 70°C, og deretter ble endogen peroksidaseaktivitet undertrykt med 3 % hydrogenperoksidbehandling. Etter hydrogenperoksidbehandling ble alle objektglass inkubert med normalt kaninserum i 30 minutter. Etter normal seruminkubering ble primære antistofffortynningsmidler fremstilt og påført prøvene over natten i et fuktet kammer ved 4⁰C. De primære antistoffene var geit polyklonalt anti-PPAR-y antistoff (1:250), anti-RXR-a antistoff (1:250) og anti-VDR antistoff (1:250). Etter inkubering av primær antistoff ble alle objektglass vasket med fosfatbufferløsning (PBS) tre ganger i fem minutter (3x5) og biotinylert immunglobulin G ble påført i 30 minutter. Igjen en vask av 3x5 PBS, alle prøvene ble eksponert for en streptavidin-pepperrotperoksidase-konjugert reagens i ytterligere 30 minutter. Etter vask med 3x5 PBS ble alle seksjoner behandlet med AEC-kromogen for å visualisere farging. Motfarging ble utført med Meyers hematoxylin, og seksjoner ble montert. Etter å ha tørket i to dager, ble prøvene undersøkt under 400x forstørrelse ved bruk av lysmikroskopi [23, 24].

Immunhistokjemisk semi-kvantitativ H SCORE-analyse Immunhistokjemi-evaluering ble utført på tre forskjellige områder i hver seksjon, og tre seksjoner ble evaluert for hver pasient. Det ble utført ni målinger for hver deltaker. Alle celler ble merket i henhold til deres farging som ingen farging '0', lav farging '1', mild farging '2' og tett farging '3'. Fargingsskårer ble konvertert til en numerisk verdi som 'H-score' gjennom en formel (∑Pi(i+l)) som er en ofte brukt verdi for immunhistokjemi [23, 24]. I denne formelen viser i fargeintensitetspoengsummen og Pi: indikerer prosentandelen av de fargede cellene.

RT-PCR-analyse Primerne som skal brukes for genene ble vist i tabell 1. RNA-isolering og RT-PCR-analyse utført i henhold til en tidligere studie [27]. Kort fortalt, for RT-PCR-analyse, ble første gingivalvev homogenisert og utsatt for sonikering for å avsløre RNA i vevene og vevssupernatanter ble oppnådd. Deretter ble supernatantene underkastet det totale mRNA-isoleringstrinnet. Vevene behandlet med Qiazole, fikk deretter inkuberes i shakeren i 5 minutter. Ved slutten av 5 minutter ble kloroform tilsatt til mediet som inneholdt cellene og inkubasjonen fortsatte i 3 minutter ved romtemperatur og deretter ble prøvene sentrifugert. På slutten av sentrifugen ble supernatanten på toppen av røret overført til et annet rør. Etterpå ble isopropanol tilsatt til supernatanten og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur, og sentrifugeringstrinnet ble gjentatt. Ved slutten av sentrifugeringen ble pelleten avsatt i bunnen vasket med 75 % etanol, gjenværende supernatant ble sentrifugert igjen og suspendert i rent, sterilt vann uten RNase. mRNA ble bestemt ved spektrofotometrisk metode. Ved bruk av qRT-PCR-settet ble ett µg mRNA transformert til ett-trinns cDNA ved bruk av spesifikke primere rettet mot genet av interesse, senere ble genene identifisert ved hjelp av qRT-PCR (Verso, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) . Resultatene ble normalisert til β-aktinkontrollgenet.

Statistisk analyse Kraften til studien var over 85 % basert på en tidligere studie med lignende studiedesign [25]. IBM SPSS-programvare ble brukt til statistisk analyse. En prøve K-S-test ble brukt for å teste normaliteten. For fibroblastcelletellinger, inflammatoriske celler og CAL, ble One Way ANOVA etterfulgt av Tukey-test brukt. For andre parametere ble Mann Whitney U og Kruskal Wallis tester brukt. Data ble presentert som gjennomsnitt ± SD eller prosentandel etter behov. p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.