RAPA-501-COVID-19-ARDS の同種療法

ヒト初の第 1 相試験コンポーネントでは、COVID-19 関連の ARDS 患者を対象に 2 つの用量レベルの RAPA-501-ALLO 既製細胞を評価し、安全性、生物学的効果、潜在的な疾患修飾効果の主要なエンドポイントを評価します。 無作為化、二重盲検、プラセボ対照第 2b 相試験コンポーネントでは、RAPA-501 細胞が 30 日死亡率を低下させるかどうかを評価する主要評価項目を使用して、RAPA-501 ALLO の市販細胞の注入または対照注入を評価します。

COVID-19 パンデミックは、罹患率と死亡率が進行する災害です。 2021 年 4 月 6 日の時点で、推定 1 億 3,210 万人がウイルスに感染し、2,866,000 人が死亡しています。 米国は推定3,080万人が診断され、556,000人が死亡しており、合計が最も多い。 米国は推定 2,240 万人が診断され、375,000 人が死亡しており、合計数が最も多い。 COVID-19 のステージ 1 および 2 では、患者内でのウイルスの増殖が優勢です。 そのため、治療介入は免疫分子 (回復期血清、モノクローナル抗体) と抗ウイルス薬 (レムデシビル) に焦点を当てています。 対照的に、COVID-19 の最も重篤で致命的なステージ 3 は、ウイルスの増殖ではなく、サイトカインやケモカインとして知られる免疫分子の増加によって引き起こされる制御不能な免疫反応 (過炎症) によって引き起こされます。 そのため、ステージ 3 疾患の治療介入は、抗サイトカイン療法 (抗 IL-6 薬) やコルチコステロイド療法などの抗炎症薬に焦点を当てています。 残念ながら、そのような介入は、「サイトカイン ストーム」と「ケモカイン ストーム」による過炎症、組織損傷、凝固亢進、多臓器不全 (肺、心臓、腎臓、肝臓など) を含む、ステージ 3 の COVID-19 の完全な病因には対処していません。脳）。 ステージ 3 疾患の肺コンポーネントには、急性呼吸窮迫症候群 (ARDS) が含まれます。これは、肺炎、敗血症、および外傷を含む無数の状態による患者死亡の最終共通経路です。 RAPA-501-ALLO の既製の同種異系ハイブリッド TREG/Th2 細胞など、広範な免疫調節効果と組織再生効果の両方を提供できる新しい細胞治療が切実に必要とされています。

実験的なマウスコロナウイルス感染症における致命的な肺炎のメカニズムは、先天的なインフラマソームの活性化、結果として生じる炎症性単球とマクロファージの強力な浸潤、およびそれに続く複数の炎症誘発性サイトカインとケモカインの増加によって媒介されます。 重要なことに、実験的なコロナウイルス感染に対する CD4+ および CD8+ 適応 T 細胞応答は、治癒または疾患の伝播のいずれかになります。 ウイルス誘発性肺炎症は非ヒト霊長類モデルでも評価されており、ウイルス性肺炎中の免疫活性化の調節不全には、T細胞サブセットの不均衡、下流の単球由来の炎症カスケード、および結果として生じる上皮細胞損傷が含まれることが確認されています。 ヒトでは、ウイルス誘発性下気道感染症の重症度は、気道内のエフェクターメモリー CD8+ T 細胞数の増加と相関しています。 最近レビューされたように、ヒトのコロナウイルス感染は、ウイルスと宿主の間で進行中の戦いを表しており、反応の性質により、病気の治癒または肺疾患の悪化が決まります。 適応免疫系がSARS関連コロナウイルス（SARS-CoV）疾患の肺炎症に寄与しているという証拠が存在します。つまり、そのような被験者の気管支肺胞液では、T細胞数が増加し、Th1関連分子IL-12、IFN-γ、そしてIP-10。 この下流の適応性 T 細胞媒介性炎症反応は、SARS-Co-V タンパク質ビロポリン 3a によって部分的に駆動されます。 具体的には、ビロポリン分子は、自然から適応への炎症反応を結びつける NLRP3 インフラマソームを活性化します。 さらに、SARS-CoV と SARS-CoV-2 はどちらもオープンリーディングフレーム ORF3a 分子を発現し、NLRP3 インフラマソームも活性化します。

症候性 COVID-19 感染の解決中の免疫の性質が最近報告されました。パーフォリンおよびグランザイムを発現する CD8+ T 細胞の増加。炎症誘発性サイトカインおよびケモカインの増加が比較的少ない。 著しく対照的に、重度の COVID-19 疾患の患者は、サイトカイン (IL-2 および TNF-α を含む) およびケモカイン (IP-10 および MIP-1-α を含む) の血漿レベルが大幅に増加していた (Huang et al., Lancet, 2020）。 まとめると、これらの結果は、重度の COVID-19 で発生する炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン応答が有害であり、効果的な抗炎症アプローチが最終的に治療に役立つ可能性があることを示しています。 ただし、以前に詳述したように、より進行したステージ 3 の COVID-19 疾患は ARDS 要素とサイトカインストームによって特徴付けられるため、COVID-19 ウイルス性肺炎を治療するための新しいアプローチは、抗炎症要素と抗炎症要素の両方を最適に組み込む必要があります。組織保護/組織修復要素。

ステージ 3 の COVID-19 は、ARDS と多臓器不全を管理するための ICU の利用、人工呼吸器、および支持療法にもかかわらず、50% を超える推定 30 日間の死亡率をもたらします。 抗 IL-6 治療薬などの標的を絞った抗炎症アプローチは、ステージ 3 の COVID-19 では特に効果的ではなく、コルチコステロイド療法の幅広い抗炎症薬学的アプローチは、いくつかの研究でステージ 3 疾患をわずかに緩和しただけです。 細胞療法は、ステージ 3 の COVID-19、特に間葉系間質細胞 (MSC) でも評価されており、現在、現在の RAPA-501-ALLO プロトコルでは、制御性 T (TREG) 細胞が評価されています。 TREG 療法には、多面的な抗炎症効果を含む作用機序があり、TREG 療法は、幅広い自己免疫疾患および神経変性疾患の将来の根治的治療に加えて、移植片対宿主などの移植合併症の最前線に立つことになります。疾患 (GVHD) および移植片拒絶。 さらに、TREG療法は組織再生効果をもたらすことができ、皮膚、筋肉、肺、肝臓、腸の疾患など、無数の組織ベースの疾患を修復するための新しい再生医療の取り組みの先頭にTREG細胞療法を置きます。心臓（心筋梗塞）と脳（脳卒中）。 RAPA-501-ALLO の市販の細胞療法は、COVID-19 および複数の致命的な状態の効果的な治療のために、抗炎症効果と組織修復効果の両方を組み込んだ、この潜在的な二重の脅威作用機序を提供します。

RAPA-501-ALLO 細胞は、健康なボランティアから生成され、凍結保存され、保管されており、いつでも市販の治療に利用できます。 製造中、T 細胞は、T 細胞の脱分化とその後の 2 つの主要な抗炎症プログラムである TREG および Th2 経路への再分化を含む、特許取得済みの新規の 7 日間の 2 段階プロセスを使用して、ex vivo で「再プログラム」されます。したがって、「ハイブリッド」製品を作成します。 ハイブリッド表現型は、COVID-19 で機能する炎症経路を阻害します。これには、複数のサイトカインやケモカインの調節が含まれ、炎症細胞を組織に引き寄せて多臓器損傷を開始させます。 RAPA-501-ALLO 細胞のハイブリッド TREG および Th2 表現型は、COVID-19 の過炎症を開始する Th1 および Th17 集団を相互制御します。 RAPA-501 の免疫調節は、T 細胞受容体に依存しない方法で行われるため、市販の細胞療法が可能になります。 最後に、ウイルス性肺炎と ARDS の実験モデルでは、TREG 細胞は肺胞組織に対する保護効果を媒介します。 同種 RAPA-501 T 細胞製品は、抗炎症効果と組織保護効果の両方を伴うこの独自の作用機序により、ステージ 3 COVID-19 関連 ARDS の設定での評価に特に適しています。

一般に、古典的な自己免疫疾患、神経変性疾患、およびウイルス誘発性炎症性疾患は、対抗制御免疫抑制 Th2 および TREG サブセットの相対的な不足を伴う Th1/Th17 型応答の優位性によって引き起こされます。 FOXP3 転写因子の発現によって部分的に定義される TREG 細胞は、自己免疫疾患、神経変性疾患、および移植片対宿主病 (GVHD) および移植片を含む移植合併症を調節する能力について、実験モデルで広く研究されています。拒絶。 重要なことに、IL-2のT細胞産生または外因性IL-2投与は、実験的ウイルス感染中に肺の炎症を引き起こします。したがって、IL-2 の消費者としての TREG 細胞の役割が知られていることを考えると、ウイルスによる肺の炎症中に TREG 細胞が有益に寄与することには、強力な機械論的根拠があります。 さらに、ウイルス誘発性の肺の炎症と肺損傷の実験的マウスモデルでは、TREG細胞の数と機能を増強する介入により、肺損傷の修復が加速されました。 また、GATA3 転写因子の発現によって部分的に定義される Th2 細胞は、30 年前に、Th1 細胞の優勢を防ぐための強力な対抗制御集団として説明されました。 臨床データは、TREG細胞を含む免疫抑制細胞集団を増加させる操作が、抗ウイルス免疫を損なうことなく、移植片対宿主病などの重度の炎症性疾患を軽減できることを示していることに注意することが重要です。 さらに、実験モデルと臨床研究の両方で、適切なレベルの TREG 細胞により、ウイルス性細気管支炎中の肺の炎症が全体的に改善される可能性があります。 まとめると、これらの調査結果は、TREG/Th2 表現型を組み合わせて発現する T 細胞が、重度のステージ 3 COVID-19 疾患に関連するウイルス誘発性肺炎症および損傷の状況において、予想通り有益な効果をもたらすことを示しています。

臨床試験では、TREG 型細胞と Th2 型細胞の両方を、さまざまな状態、最も顕著な移植合併症について評価しました。 一般に、胸腺由来の天然（n）TREG細胞は、胸腺後誘導（i）TREG細胞よりも安定した表現型を発現すると考えられています。比較すると、iTREG 細胞はより強力な抑制を仲介できます。 それにもかかわらず、nTREG 細胞と iTREG 細胞の両方が分化可塑性の影響を受けやすく、潜在的に治療効果のある TREG 集団が in vivo で病原性 Th1/Th17 表現型に変換される可能性があるという懸念が生じます。 Ex vivo 拡大 (n) TREG 細胞は、臍帯血ドナーを使用した同種造血細胞移植 (HCT) の設定で評価されました。最近では、同じ研究グループが、移植合併症を制限するための ex vivo 拡大 (i)TREG 細胞療法を開発しました。 さらに、エクスビボで拡大したnTREG細胞は、I型糖尿病の設定で評価されています。この臨床試験では、TREG 療法が安全であり、疾患管理の改善に少なくとも一時的に有効であることがわかりました。 さらに、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) の状況では、重度の Th1 駆動の末梢および中枢の炎症反応によって伝播される疾患であり、nTREG 細胞の養子移入の臨床試験により、介入が安全であることが確認され、 ALS 疾患の改善。 最後に、低強度同種 HCT の設定におけるラパマイシン耐性 Th2 細胞療法の第 II 相研究では、養子 Th2 細胞移植は安全であり、in vivo での Th2 分極へのシフト、ドナー生着の保存、混合キメリズムの安定化と関連していた、低率の GVHD、および難治性血液悪性腫瘍患者における強力な抗腫瘍効果。 まとめると、これらの臨床試験の結果は、TREG および Th2 型集団の養子移入が同種 HCT 設定であっても安全に投与でき、炎症状態の有益な調節を媒介できることを示しています。

Ex vivo 製造は、末梢 T 細胞の胸腺後プールから誘導 (i) TREG 細胞を生成するために利用できます。 現在のプロトコルでは、製造方法は、TREG 細胞の誘導を促進する確立された介入である mTOR 阻害に焦点を当てます。 mTOR 阻害と組み合わせて、使用される培養システムには、Th2 と TREG の両方の表現型、すなわち IL-4、TGF-ベータ、および IL-2 を促進するサイトカインが組み込まれています。 最後に、プロトコルには、CD4+ および CD8+ T 細胞サブセットの両方で構成される TREG/Th2 細胞製品が含まれます。これは、これらのカウンターレギュラトリー T 細胞サブセットが差動 T 細胞受容体 (TCR) レパートリーと潜在的に強化できるエフェクターメカニズムの多様性を表現するためです。抗炎症効果。 RAPA-501 の製造では、末梢血単核細胞を定常状態のアフェレーシスから収集し、次の 2 段階の培養介入を行います。選択的培地の利用と、mTOR シグナル伝達を強力に阻害する FDA 承認の医薬品の追加。ステップ 2 では、T 細胞の再分化が、共刺激剤と Th2 型および TREG 型の分極サイトカインを使用して発生します。 培養で 6 日間後、得られた TREG/Th2 集団は、プロトコル主導の治療用量で使い捨てアリコートで凍結保存されます。 タイプ II サイトカイン表現型の T 細胞は、転写因子 GATA3 の発現によって部分的に特徴付けられますが、制御性 T 細胞集団は、FOXP3 転写因子の発現によって部分的に識別されます。 培養開始時に、非常に低い頻度の T 細胞が GATA3 または FOXP3 のいずれかを発現します。 対照的に、TREG/Th2 培養条件で製造された RAPA-501 細胞製品は、GATA3 の単一陽性、FOXP3 の単一陽性、または GATA3 と FOXP3 の両方の二重陽性のいずれかである高頻度の T 細胞を発現します。 重要なことに、この転写因子プロファイルは、製造された CD4+ および CD8+ T 細胞の両方で発現します。 GVHD を強力に抑制する CD8+ TREG 集団を含む、TREG 機能を持つ CD4+ および CD8+ T 細胞集団の両方が定義されていることに注意することが重要です。 CD4+ および CD8+ TREG 細胞は異なるエフェクターメカニズムを利用するため、両方のサブセットを治療用製品に含めることは潜在的に有利です。

制御性 T 細胞集団は、免疫抑制性アデノシン基質に向かって炎症誘発性 ATP を加水分解するように作用する CD39 および CD73 エクトヌクレオチダーゼ分子の発現など、いくつかの定義されたメカニズムによって病原性エフェクター T 細胞集団を抑制することができます 。 実際、CD39 を発現する TREG 細胞は抑制機能が向上しており、炎症性腸疾患の解消に関連しています。 さらに、ヒト TREG 細胞の抑制機能は、CD73 によって部分的に媒介されます。 TREG/Th2培養条件で製造されたT細胞は、TREG関連エフェクター分子であるCD39およびCD73の発現が増加しています。 CD39/CD73 エクトヌクレオチダーゼに加えて、TREG 細胞の機能は、上皮リンパ球の局在を決定するインテグリンである CD103 の発現とも相関しています。 実際、CD103 と IL-2 受容体シグナル伝達は協力して腸粘膜の免疫寛容を維持します。さらに、CD103 発現 TREG 細胞は、実験的な慢性 GVHD の改善に重要です。 TREG/Th2 培養条件で製造された T 細胞は、TREG エフェクター分子 CD103 の発現が増加しています。

実験モデルでは、養子 T 細胞療法の有効性は、生着の成功と in vivo での T 細胞の持続性に依存します。 重要なことに、T 細胞の分化状態は in vivo での持続性を決定するのに役立ち、分化度の低い細胞ほど持続性が高くなります。 T セントラル メモリー (TCM) 表現型を発現するマウス ラパマイシン耐性 T 細胞は、コントロール T 細胞と比較して in vivo での生着の可能性が増加していました。 さらに、ヒト ラパマイシン耐性 T 細胞は、異種移植片対宿主病のヒトからマウスへのモデルでも生着が増加していました。 T エフェクター メモリー (TEM) 集団と比較して分化が減少した T 細胞は、in vivo 持続性が増加し、TCM サブセット、ナイーブ T 細胞サブセット、さらに最近では T 幹細胞メモリー (TSCM) などの in vivo 効果の増加を媒介します。サブセット。 T 細胞分化状態と in vivo T 細胞機能との間のこの関係は、TREG 細胞に関連しています。 (2) 幹細胞マーカー CD150 を発現する TREG 細胞は、幹細胞移植片拒絶反応の予防に非常に効果的でした。 TREG/Th2 培養条件で製造された T 細胞は、CD150 マーカーの発現を含む、T 幹細胞サブセットと一致する分化状態の低下した細胞が濃縮されています。

製造された RAPA-501 細胞のサイトカイン分泌プロファイルを評価することも重要です。 まず、細胞産物が、その後の Th2 分化のドライバー サイトカインである IL-4 を分泌できることが重要です。 第二に、養子移入された T 細胞集団が IL-2 を分泌できることが望ましいです。この能力は、T 細胞が外因性 IL-2 を必要とせずに in vivo でより容易に拡大できるようにする前駆細胞機能を示しているからです。 最後に、RAPA-501 細胞集団では、Th1 または Th17 型のサイトカインである IFN-γ、TNF-α、IL-17、および GM-CSF の分泌が減少していることが重要です。 製造された RAPA-501 細胞製品は、IL-4 および IL-2 を分泌し、Th1 または Th17 型サイトカインの分泌は最小限です。

制御性 T 細胞は、エフェクター T 細胞の増殖または機能を抑制する能力によっても定義できます。 重要なことに、製造された TREG/Th2 細胞は、IFN-γ、GM-CSF、および TNF-α を含む複数の炎症性サイトカインの Th1/Tc1 細胞分泌を強力に抑制します。 抑制のメカニズムを評価するために、transwell アッセイを使用して実験を行いました。これにより、エフェクター T 細胞と RAPA-501 細胞は、細胞間接触を防止するが、サイトカインなどの小さな可溶性メディエーターによる細胞伝達を可能にするフィルターによって分離されます。 RAPA-501 細胞は、TCR に依存しない方法で作用し、エフェクター T 細胞のサイトカイン分泌能を抑制しました。 RAPA-501 細胞を含むトランスウェルチャンバーには共刺激が提供されなかったため、RAPA-501 細胞は、IL-2、IFN-γ、GM-CSF、および TNF-α を含む炎症性サイトカインレベルを調節するために共刺激を必要としませんでした。 . 次のサイトカインおよびケモカインは、このトランスウェルアッセイで RAPA-501 細胞によって減少し、RAPA-501 細胞の CD4+ および CD8+ サブセットによって媒介される抑制は比較的同等でした: CCL1、CCL2、CCL7、CCL11、CCL13、CCL17、CCL20、CCL22、CCL26 、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、IL-6、IFN-ガンマ、GM-CSF、および IL-10。 TREG細胞がIL-2を消費する能力は、一般的に説明されている現象ですが、以前の研究では、IL-2の消費には細胞間接触が必要であることが確認されています。 そのため、RAPA-501 細胞は、接触に依存しない方法で複数の炎症性サイトカインのレベルを独自に調節することができます。 これらの結果は、RAPA-501 細胞が、ウイルス誘発性肺炎症を含むさまざまな疾患に関連する複数のサイトカインおよびケモカインの中和に適した候補であることを示唆しています。 RAPA-501 細胞製品が TCR に依存しない方法で T 細胞媒介性炎症を抑制するこの能力に照らして、RAPA-501 療法は、同種異系の市販の治療用途に非常に適しています。

RAPA-501細胞産物が、末梢単球集団に類似する骨髄由来細胞であるヒトCNSミクログリア細胞も調節するかどうかを評価するために、さらなる実験を行った。 RAPA-501 細胞産物が炎症誘発性ミクログリア細胞を接触非依存的に調節するかどうかを評価するために、ミクログリア細胞株 HMC3 の炎症状態を軽減する RAPA-501 細胞の能力をトランスウェルアッセイでテストしました。 RAPA-501 細胞は、1:40 の RAPA-501 細胞とミクログリア細胞の比較的低い比率で、炎症誘発性サイトカイン IL-6 と IFN-ガンマ、および炎症誘発性ケモカイン IP-10 の HMC3 細胞分泌を減少させました。 これらの結果は、RAPA-501 製品が骨髄由来集団からのサイトカインおよびケモカインの分泌を接触および TCR に依存しない方法で阻害できることを示しており、それによって RAPA- 501製品。

T細胞表現型の安定性に関するRAPA-501細胞産物も評価した。 すなわち、ＴＲＥＧ細胞療法の制限要因は、例えば、ＴＲＥＧ細胞が炎症性サイトカインの影響を受けてＴＲＥＧ特性を失い、Ｔｈ１型炎症状態を採用する分化可塑性である可能性があると判断された。病気の病因。 この可能性に対処するために、T 細胞共刺激、mTOR 阻害剤の非存在、分極化炎症性サイトカイン IFN-α および IL の存在を含む延長された培養間隔の後に T 細胞分化転写因子を調節する RAPA-501 細胞の能力。 -6 を検討した。 これらの実験は、RAPA-501細胞産物が顕著な分化安定性を有することを実証した(CD4+およびCD8+サブセットにおけるFOXP3およびGATA3の持続的発現;TBETのアップレギュレーションの欠如)。

要約すると、RAPA-501 細胞は、制御性 T 細胞集団と一致する表現型を発現します。 TREG 機能分子 CD39、CD73、および CD103 の発現。幹細胞マーカーCD150の発現を含む、T細胞分化の低下した状態の発現; Th1/Th17タイプのサイトカインの分泌が最小限であるサイトカインのTh2パターンの分泌。複数の炎症性サイトカインおよびケモカインのレベルの低下を含む、エフェクター Th1/Tc1 細胞および炎症誘発性骨髄細胞の両方に対する機能的抑制能力。接触およびTCRに依存しない方法で炎症性エフェクターを阻害する能力。 まとめると、RAPA-501 製品のこれらの特徴は、この治療法が COVID-19 関連の ARDS を治療するための新規で有望な候補であることを予測しています。

これは、COVID-19 関連 ARDS の参加者における同種 RAPA-501 細胞療法を評価する、初のヒト第 1 相/第 2b 相試験です。 2 つの第 1 相コホート、すなわち低用量コホート 1 (40 x 10^6 細胞/注入) と高用量コホート 2 (160 x 10^6 細胞/注入) が評価されます。このフェーズ 1 コンポーネントは、主要エンドポイントとして用量制限毒性 (DLT) を利用します。 第 1 相試験コンポーネントで安全性が実証されている場合、各 RAPA-501 用量コホートは無作為化された第 2b 相コンポーネントで評価できます。 フェーズ 2b コンポーネントでは、安全であると判断された RAPA-501 の用量レベルごとに、患者は RAPA-501 細胞 (n=19) またはプラセボ (n=19) を受けるように無作為に割り付けられます。 RAPA-501 細胞またはプラセボのいずれかを注入した後、これらの無作為化コホートは標準治療を継続します (プロトコル駆動型ではありません)。 第 2b 相試験の主要評価項目は 30 日間の死亡率であり、無作為化されたプラセボ対照コホートと比較して RAPA-501 レシピエントの死亡率を下げるという統計的目標があります。

研究参加者は、COVID-19 関連の ARDS、具体的には以下の入院患者でなければなりません。放射線検査での肺浸潤;高流量鼻カニューレや機械換気などの非侵襲的換気を含む集中的な呼吸補助を必要とするARDSの診断。 この研究は、(1) 研究登録ステップ (スクリーニング) で構成されます。 (2)適格性が確認された後、RAPA-501細胞の注入が行われます。 コホート 1 では、RAPA-501 細胞の注入は 40 x 10^6 細胞/注入の用量になります。 3人の参加者が最初に治療され、このフェーズ1コンポーネントの参加者を1週間分離してDLTを評価します。これは、注入の7日以内にRAPA-501細胞に起因するグレード3以上の毒性として定義されます。 コホート 1 の治療が安全であると判断された時点 (0/3 または 1/6 のいずれかが DLT) で、コホート 1 の RAPA-501 治療を無作為化第 2b 相試験コンポーネントで評価して、関連する主要な試験目的に取り組むことができます。 30日死亡まで。 コホート 1 の治療が安全であると判断された時点で、コホート 2 の治療を開始できます。これにより、RAPA-501 細胞の注入が 160 x 10^6 細胞/注入の用量で評価されます。 コホート 1 と同様に、コホート 2 の治療が安全であると判断された場合、コホート 2 の RAPA-501 治療は、無作為化第 2b 相試験コンポーネントで評価され、30 日死亡率に関する主要な試験目的に対処することができます。 この研究は、次の 3 つの主な段階で構成されます。 (2)潜在的な有効性および安全性エンドポイントの比較的集中的な臨床モニタリングを継続するための延長された合計90日間の間隔。 （3）長期の臨床フォローアップを提供し、免疫およびウイルスのエンドポイントに関連する検査パラメーターを監視し続けるために、合計6か月の延長された間隔。