ポルフィロモナス・ジンジバリスに対するフランキンセンス抽出物の抗菌および抗バイオフィルム活性

この研究は、中等度から重度の慢性歯周炎 (グレード III ステージ b 歯周炎) と診断され、歯学部の歯周病学クリニックから選ばれた、年齢 25 歳から 50 歳までの男女の全身的に健康な患者 30 人を対象に実施されました。タンタ大学

歯肉溝液サンプル (GCF) は、深さ 5 mm 以上のポケットから採取し、紙の先端でプロービング (活動性疾患) で陽性の出血を示しました。 サンプルは、サンプリングする歯から歯肉縁上のプラークを除去した後、歯周ポケットから得られました。 次いで、歯肉縁下プラークサンプルを、５μｇ／ｍＬのヘミンおよび１μｇ／ｍＬのメナジオン（ビタミンＫ１）を補充した２ｍｌのブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスに接種した。 次に、それらを希釈し、5% ヒツジ血液、ヘミン (5 μg/mL)、およびビタミン K1 (0.5 μg/mL) を添加した血液寒天培地で培養しました。 これらのプレートは、嫌気性雰囲気中、37 °C で 7 ～ 10 日間、二重に培養されました。 成長したバクテリアは、色、サイズ、および形状に基づいて最終的に選択されました。 黒色に着色されたコロニーおよびグラム陰性桿菌（顕微鏡で検査した場合）を、長波UV光を使用した蛍光試験によって検査しました。 蛍光がないことで、P. gingivalis と他の嫌気性で黒色に着色したグラム陰性の桿菌が区別されます。 次に、API 20A (BioMérieux、フランス) を使用して、P. gingivalis 分離株の同定を確認しました。

4.8. 抗菌スクリーニングは寒天拡散法[40]を用いて行った。 簡単に言えば、細菌懸濁液を、5% ヒツジ血液、1% (v/v) ヘミン、および 1% (v/v) ビタミン K1 を添加した血液寒天プレート表面に分配し、滅菌した 6 mm ブランク フィルター ペーパー ディスクに0.5 ～ 1000 μg/ml の範囲のさまざまな濃度のフランキンセンスオレオレジン抽出物 25 μl。 10% DMSO をロードしたディスクをネガティブ コントロールとして使用し、テトラサイクリン ディスク (30 μg) をポジティブ コントロールとして使用しました。 すべてのペトリ皿は、嫌気的に37℃で48時間インキュベートされました。 阻害ゾーンの直径を測定し、ディスクの周りに透明なゾーン（阻害ゾーン）を示したフランキンセンス抽出物の濃度を、試験した細菌に対して阻害効果があるとみなした。

4.9。 MIC 値の決定 P. gingivalis 分離株に対するフランキンセンス抽出物の MIC 値は、ブロス微量希釈法を使用して推定されました。 簡単に説明すると、ヘミン (5 μg/mL) とビタミン K1 (1 μg/mL) を含む BHI ブロスで、P. gingivalis の培養物を一晩培養しました。 次に、100 μL の細菌と 100 μL の乳香抽出物の連続希釈 (2 倍) (2000 μg/mL から開始) を BHI で微量滴定プレートのウェルに混合しました。 各微量滴定プレートには、細菌を含まない BHI ウェルを含む陰性対照ウェルと、抽出物を含まない細菌のみを含む陽性対照ウェルがありました。 37℃で24時間嫌気培養した後、細菌の増殖を視覚的に検査した。 ＭＩＣ値は、細菌増殖の阻害を引き起こした最低濃度として記録された。 以下のすべての実験は、フランキンセンス抽出物のサブ阻害濃度 (0.5 MIC) による P. gingivalis 分離株の処理の前後に実施されました。

4.10. 細菌増殖曲線 P. gingivalis 分離株は、5% ヒツジ血液、ヘミン (5 μg/mL)、およびビタミン K1 (0.5 μg/mL) を添加した血液寒天プレートで、37° の嫌気的条件下で 5 ～ 7 日間培養しました。 C [43]。 次に、各分離株のシングル コロニーを、ヘミン (5 μg/mL) とビタミン K1 (1 μg/mL) を含む BHI ブロスに接種し、24 時間嫌気的に増殖させました。 600 nm での光学密度 (OD) 値を 2 時間ごとに検出しました。 UV-VIS分光光度計（島津、日本）を使用して、サンプリング時間（時間）に対して対数ODをプロットすることにより、成長曲線を作成しました。

4.11. 核酸漏出の測定 細菌細胞からの核酸の放出は、前述のように測定した。 対数期の P. gingivalis 分離株を遠心分離し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に再懸濁し、嫌気条件下でインキュベートしました。 細胞核酸の放出は、0、1、2、および 4 時間の異なる時間で測定されました。 1800 UV-VIS分光光度計（島津、日本）を使用して260 nmでの吸光度を測定することにより。

4.12. フランキンセンスエキスの抗バイオフィルム活性

前述のように実行されました。 簡単に言えば、100 μLのP.ジンジバリス懸濁液を接種し、37°C​​の嫌気条件で96ウェル微量滴定プレートに培養しました。 72時間培養後、非接着細胞をPBSで洗浄して除去し、1時間乾燥させた。 0.1% クリスタル バイオレットの溶液を使用してバイオ フィルムを染色し、サンプルを蒸留水で洗浄しました。 バイオフィルム生成の定量分析のために、125 μL の 30% 酢酸を添加し、ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan、オーストリア) を使用して 492 nm での OD を測定しました。 バイオフィルムの減少率は、次の式を使用して計算されました。

バイオフィルム形成減少率＝（未処理ＯＤ－処理ＯＤ）／（未処理ＯＤ）×１００ 細胞外多糖類の測定 形成されたバイオフィルムの細胞外高分子物質（ＥＰＳ）に含まれる多糖類は、フェノール硫酸法を用いて推定した［ 43]。 簡単に言えば、微量滴定プレートは、P.ジンジバリス分離株によるバイオフィルム形成の3日後、PBSで洗浄して浮遊細菌を除去し、空気乾燥させました。 次に、40 μL の滅菌水と 40 μL の 6% フェノール溶液、続いて 200 μL の 97% 硫酸を各ウェルに加えました。 次いで、プレートを室温で３０分間放置し、形成されたバイオフィルム中の多糖類の数を、ＥＬＩＳＡ Ａｕｔｏ Ｒｅａｄｅｒ（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｔｅｃａｎ、オーストリア）を使用して４９０ｎｍのＯＤで吸光度を測定することによって決定した。 OD 値を多糖濃度に変換するための標準として、さまざまなグルコース濃度 (0、5、10、20、および 100 mg/L) を使用しました。

4.14. 細菌細胞表面の疎水性

細菌の疎水性は、炭化水素-キシレン試験を使用して評価されました。 簡単に説明すると、P. gingivalis 分離株を嫌気的に培養し、遠心分離後に収集したペレットをリン酸尿素硫酸マグネシウム緩衝液 (PUM 緩衝液、pH 6.9) に再懸濁しました。 次に、0.3、0.9、1.2、および 1.8 ml の n-ヘキサンを 4.8 ml の細菌懸濁液に加えました。 混合物を２時間放置し、水相を注意深く分離した。 水相に残った試験分離株の吸光度を 540 nm で測定しました。 HI は、次の式によって識別されました。

ＨＩ＝（Ａ５４０対照－Ａ５４０試験）／（Ａ５４０対照） ４．１５． 光学顕微鏡と SEM によるバイオ フィルムの形態の検査 Qi らに従って実施されました。 簡単に説明すると、カバー ガラス スライドの 2 つのグループに P. gingivalis 分離株 (乳香抽出物を含むものと含まないもの) を浸し、嫌気条件下で 3 日間放置して、分離株がバイオ フィルムを形成できるようにしました。 P.ジンジバリス分離株によって形成されたバイオフィルムの最初のグループは、クリスタルバイオレットで染色した後、100倍の倍率を使用して明視野顕微鏡（Labomed、アメリカ）によって視覚化されました。 形成されたバイオ フィルムの 2 番目のグループは、PBS を使用してすすぎ、4 ° C で 24 時間 2.5% グルタルアルデヒド溶液に沈めました。 次に、一連のエタノールを使用して順次脱水しました。 30％から100％の範囲の濃度で、乾燥させ、SEM（日立、日本）で検査するために金でスパッタコーティングしました。

4.16. qRT-PCR qRT-PCRを使用して、fimA、hagA、hagB、rgpAおよびkgp遺伝子の相対的遺伝子発現を調べた。 使用したプライマーは表S1に記載されており、16S rRNA遺伝子はハウスキーピング遺伝子または内因性コントロールでした。 すべての実験は 3 回実行され、結果の値は平均 ± 標準偏差 (SD) として表されました。 Rotor-Gene Q5プレックス機器（Qiagen、ドイツ）を使用して、Power SYBR（登録商標）Greenマスターミックス（Thermo SCIENTIFIC、米国）によって増幅を行った。 相対遺伝子発現は、対照サンプルとして未処理の分離株を使用して2-ΔΔCtの方法を使用して決定されました（その発現は1に設定されました）。 2倍以上の遺伝子発現の変化（増加または減少）は、統計的に有意であると見なされました