Antibakterielle und Anti-Biofilm-Aktivität von Weihrauchextrakt gegen Porphyromonas Gingivalis

Die Studie wurde an 30 systemisch gesunden Patienten beiderlei Geschlechts im Alter von 25 bis 50 Jahren durchgeführt, bei denen eine mittelschwere bis schwere chronische Parodontitis (Parodontitis Stadium III Grad III) diagnostiziert wurde und die aus der Klinik für Parodontologie, Fakultät für Zahnmedizin, ausgewählt wurden. Tanta-Universität

Zahnfleischtaschenflüssigkeitsproben (GCF) wurden aus Taschen mit einer Tiefe von ≥ 5 mm und positiver Blutung beim Sondieren (aktive Erkrankung) mit einer Papierspitze entnommen. Proben wurden aus den periodontalen Taschen entnommen, nachdem die supragingivale Plaque von den zu beprobenden Zähnen entfernt worden war. Die subgingivalen Plaqueproben wurden dann in 2 ml Hirn-Herz-Infusionsbrühe (BHI), ergänzt mit 5 &mgr;g/ml Hämin und 1 &mgr;g/ml Menadion (Vitamin K1), inokuliert. Sie wurden dann verdünnt und auf Blutagar kultiviert, das mit 5 % Schafblut, Hämin (5 &mgr;g/ml) und Vitamin K1 (0,5 &mgr;g/ml) ergänzt war. Diese Platten wurden zweifach für 7–10 Tage bei 37°C in einer anaeroben Atmosphäre inkubiert. Die gezüchteten Bakterien wurden schließlich anhand ihrer Farbe, Größe und Form ausgewählt. Die schwarz pigmentierten Kolonien und gramnegativen Stäbchen (bei mikroskopischer Untersuchung) wurden durch einen Fluoreszenztest mit langwelligem UV-Licht untersucht. Das Fehlen von Fluoreszenz unterscheidet zwischen P. gingivalis und anderen anaeroben, schwarz pigmentierten, gramnegativen Stäbchen. Die Identifizierung von P. gingivalis-Isolaten wurde dann unter Verwendung von API 20A (BioMérieux, Frankreich) bestätigt.

4.8. Antibakterielles Screening Es wurde mit der Agar-Diffusionsmethode durchgeführt [40]. Kurz gesagt, Bakteriensuspension wurde auf Blutagarplattenoberflächen verteilt, die mit 5 % Schafblut, 1 % (v/v) Hämin und 1 % (v/v) Vitamin K1 ergänzt waren, dann wurden sterilisierte 6 mm leere Filterpapierscheiben damit imprägniert 25 µl Weihrauchölharzextrakt mit unterschiedlichen Konzentrationen von 0,5 bis 1000 µg/ml. Mit 10% DMSO beladene Scheiben wurden als negative Kontrollen verwendet und Tetracyclin-Scheiben (30 &mgr;g) wurden als positive Kontrolle verwendet. Alle Petrischalen wurden 48 Stunden lang bei 37°C anaerob inkubiert. Hemmhofdurchmesser wurden gemessen und die Konzentrationen von Weihrauchextrakt, die klare Zonen (Hemmhof) um die Scheiben herum zeigten, wurden als hemmend auf die getesteten Bakterien angesehen.

4.9. Bestimmung der MHK-Werte Die MHK-Werte von Weihrauchextrakt gegen P. gingivalis-Isolate wurden unter Verwendung der Bouillon-Mikroverdünnungsmethode geschätzt. Kurz gesagt, Kulturen von P. gingivalis wurden über Nacht in BHI-Brühe gezüchtet, die Hämin (5 &mgr;g/ml) und Vitamin K1 (1 &mgr;g/ml) enthielt. Dann wurden 100 &mgr;l Bakterien plus 100 &mgr;l Reihenverdünnungen (zweifach) des Weihrauchextrakts (ab 2000 &mgr;g/ml) in BHI in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gemischt. Jede Mikrotitrationsplatte hatte eine negative Kontrollvertiefung, die BHI ohne Bakterien enthielt, und eine positive Kontrollvertiefung, die nur Bakterien ohne den Extrakt enthielt. Nach anaerober Inkubation bei 37°C für 24 Stunden wurde das Bakterienwachstum visuell untersucht. Die MHK-Werte wurden als die niedrigsten Konzentrationen erfasst, die eine Hemmung des Bakterienwachstums bewirkten. Alle folgenden Experimente wurden vor und nach der Behandlung von P. gingivalis-Isolaten mit subinhibitorischen Konzentrationen (0,5 MIC) des Weihrauchextrakts durchgeführt.

4.10. Bakterienwachstumskurve P. gingivalis-Isolate wurden auf Blutagarplatten, ergänzt mit 5 % Schafblut, Hämin (5 μg/ml) und Vitamin K1 (0,5 μg/ml), für 5–7 Tage unter anaeroben Bedingungen bei 37°C kultiviert C [43]. Dann wurde eine einzelne Kolonie jedes Isolats in BHI-Brühe geimpft, die Hämin (5 &mgr;g/ml) und Vitamin K1 (1 &mgr;g/ml) enthielt, und 24 Stunden lang anaerob gezüchtet. Die Werte der optischen Dichte (OD) bei 600 nm wurden alle 2 Stunden erfasst. unter Verwendung eines UV-VIS-Spektrophotometers (Shimadzu, Japan), und die Wachstumskurven wurden durch Auftragen des log OD gegen die Probenahmezeit (Std.) konstruiert.

4.11. Messung des Nukleinsäurelecks Die Freisetzung von Nukleinsäuren aus den Bakterienzellen wurde wie zuvor beschrieben gemessen. P. gingivalis-Isolate in der log-Phase wurden zentrifugiert und die Pellets wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert und unter anaeroben Bedingungen inkubiert. Die Freisetzung von zellulären Nukleinsäuren wurde zu verschiedenen Zeiten von 0, 1, 2 und 4 Stunden gemessen. durch Messen der Extinktion bei 260 nm unter Verwendung eines 1800 UV-VIS-Spektrophotometers (Shimadzu, Japan).

4.12. Antibiofilmaktivität von Weihrauchextrakt

Es wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, 100 &mgr;l P. gingivalis-Suspensionen wurden inokuliert und in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen unter anaeroben Bedingungen bei 37°C kultiviert. Nach 72-stündiger Inkubation wurden die nicht anhaftenden Zellen durch Waschen mit PBS entfernt und 1 Stunde lang trocknen gelassen. Die Biofilme wurden mit einer Lösung aus 0,1 % Kristallviolett angefärbt und die Proben mit destilliertem Wasser gewaschen. Zur quantitativen Analyse der Biofilmproduktion wurden 125 µl 30 %ige Essigsäure zugegeben und die OD bei 492 nm mit ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Österreich) gemessen. Der Prozentsatz der Biofilmreduktion wurde nach folgender Formel berechnet:

% Reduktion der Biofilmbildung = (OD unbehandelt – OD behandelt)/(OD unbehandelt) x 100 Messung der extrazellulären Polysaccharide Die in der extrazellulären polymeren Substanz (EPS) des gebildeten Biofilms gefundenen Polysaccharide wurden unter Verwendung der Phenol-Schwefelsäure-Methode abgeschätzt [ 43]. Kurz gesagt, Mikrotitrationsplatten wurden nach 3 Tagen Biofilmbildung durch P. gingivalis-Isolate mit PBS gewaschen, um die frei schwebenden Bakterien zu entfernen, und luftgetrocknet. Dann wurden 40 &mgr;l steriles Wasser plus 40 &mgr;l 6%ige Phenollösung, gefolgt von 200 &mgr;l 97%iger Schwefelsäure, in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden dann 30 min bei Raumtemperatur belassen und die Anzahl der Polysaccharide im gebildeten Biofilm wurde durch Messung der Extinktion bei einer OD von 490 nm unter Verwendung von ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Österreich) bestimmt. Wir haben verschiedene Glukosekonzentrationen (0, 5, 10, 20 und 100 mg/l) als Standard verwendet, um die OD-Werte in Polysaccharidkonzentrationen umzuwandeln.

4.14. Hydrophobie der bakteriellen Zelloberfläche

Die bakterielle Hydrophobie wurde unter Verwendung des Kohlenwasserstoff-Xylol-Tests bewertet. Kurz gesagt, P. gingivalis-Isolate wurden anaerob kultiviert und die nach der Zentrifugation gesammelten Pellets wurden in Phosphat-Harnstoff-Magnesiumsulfat-Puffer (PUM-Puffer, pH 6,9) resuspendiert. Dann wurden Volumina von 0,3, 0,9, 1,2 und 1,8 ml n-Hexan zu 4,8 ml der Bakteriensuspension gegeben. Die Mischungen wurden 2 Stunden stehengelassen und die wässrige Phase wurde vorsichtig abgetrennt. Die Extinktion der getesteten Isolate, die in der wässrigen Phase verblieben, wurde bei 540 nm gemessen. HI wurde durch die folgende Gleichung identifiziert:

HI = (A540-Kontrolle – A540-Test)/(A540-Kontrolle) 4.15. Untersuchung der Biofilm-Morphologie durch Lichtmikroskop und SEM Es wurde gemäß Qi et al. Kurz gesagt wurden zwei Gruppen von Glasdeckgläsern mit P. gingivalis-Isolaten (mit und ohne Weihrauchextrakt) überflutet und drei Tage lang unter anaeroben Bedingungen belassen, damit die Isolate Biofilme bilden konnten. Die erste Gruppe der gebildeten Biofilme von P. gingivalis-Isolaten wurde mit einem Hellfeldmikroskop (Labomed, Amerika) mit 100-facher Vergrößerung nach Färbung mit Kristallviolett sichtbar gemacht. Die zweite Gruppe der gebildeten Biofilme wurde unter Verwendung von PBS gespült und in 2,5 % Glutaraldehydlösung für 24 Stunden bei 4°C eingetaucht. Dann wurden sie nacheinander unter Verwendung einer Reihe von Ethanol; Konzentrationen im Bereich von 30 % bis 100 %, trocknen gelassen und mit Gold sputterbeschichtet zur Untersuchung mit SEM (Hitachi, Japan).

4.16. qRT-PCR Die relative Genexpression der Gene fimA, hagA, hagB, rgpA und kgp wurde mittels qRT-PCR untersucht. Die verwendeten Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt, und das 16S-rRNA-Gen war das Haushaltsgen oder die endogene Kontrolle. Alle Experimente wurden dreimal durchgeführt und die Ergebniswerte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Die Amplifikation wurde mit Power SYBR® Green Mastermix (Thermo SCIENTIFIC, USA) unter Verwendung des Rotor-Gene Q5 Plex Instruments (Qiagen, Deutschland) durchgeführt. Die relative Genexpression wurde mit der Methode von 2-ΔΔCt unter Verwendung der unbehandelten Isolate als Kontrollproben bestimmt (ihre Expression wurde auf 1 gesetzt). Veränderungen der Genexpression mit ≥ 2-fach (erhöht oder erniedrigt) wurden als statistisch signifikant angesehen