Antibakteriell og antibiofilmaktivitet av røkelsesekstrakt mot Porphyromonas Gingivalis

Studien ble utført på 30 systemisk friske pasienter av begge kjønn deres alder varierte fra 25 til 50 år, diagnostisert med moderat til alvorlig kronisk periodontitt (grad III stadium b periodontitt), og valgt fra klinikken for periodontologi, Det odontologiske fakultet, Tanta universitet

Gingival crevicular væskeprøver (GCF) ble samlet fra lommer med ≥ 5 mm dybde og positiv blødning ved sondering (aktiv sykdom) med en papirspiss. Prøver ble tatt fra periodontale lommer etter fjerning av supragingival plakk fra tennene som skulle prøves. De subgingivale plakkprøvene ble deretter inokulert i 2 ml hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong supplert med 5 μg/mL hemin og 1 μg/mL menadion (vitamin K1). De ble deretter fortynnet og dyrket på blodagar supplert med 5 % saueblod, hemin (5 μg/mL) og vitamin K1 (0,5 μg/mL). Disse platene ble inkubert i duplikat i 7-10 dager ved 37 °C i en anaerob atmosfære. Bakteriene som ble dyrket ble til slutt valgt ut basert på farge, størrelse og form. De svartpigmenterte koloniene og gramnegative stengene (når de ble undersøkt mikroskopisk) ble undersøkt ved en fluorescenstest ved bruk av langbølget UV-lys. Fraværet av fluorescens skiller mellom P. gingivalis og andre anaerobe, svartpigmenterte, gramnegative staver. Identifikasjonen av P. gingivalis-isolater ble deretter bekreftet ved bruk av API 20A (BioMérieux, Frankrike).

4.8. Antibakteriell screening Det ble utført ved bruk av agar-diffusjonsmetoden [40]. Kort fortalt ble bakteriesuspensjon fordelt på blodagarplateoverflater supplert med 5 % saueblod, 1 % (v/v) hemin og 1 % (v/v) vitamin K1, deretter ble steriliserte 6 mm blanke filterpapirskiver impregnert med 25 µl røkelse oleoresinekstrakt med forskjellige konsentrasjoner fra 0,5 til 1000 µg/ml. Plater lastet med 10 % DMSO ble brukt som negative kontroller og tetracyklinskive (30 µg) ble brukt som positiv kontroll. Alle petriskåler ble anaerobt inkubert ved 37°C i 48 timer. Hemmingssonediametre ble målt og konsentrasjonene av røkelsesekstrakt som viste klare soner (inhiberingssone) rundt skivene ble ansett å ha en hemmende effekt på de testede bakteriene.

4.9. Bestemmelse av MIC-verdier MIC-verdiene for røkelsesekstrakt mot P. gingivalis-isolater ble estimert ved bruk av buljong-mikrofortynningsmetoden. Kort fortalt ble kulturer av P. gingivalis dyrket over natten i BHI-buljong som inneholdt hemin (5 µg/ml) og vitamin K1 (1 µg/ml). Deretter ble 100 µL bakterier pluss 100 µL seriefortynninger (to ganger) av røkelsesekstraktet (startende fra 2000 µg/ml) i BHI blandet i brønnene på mikrotitreringsplaten. Hver mikrotitreringsplate hadde en negativ kontroll-brønnholdig BHI uten bakterier og en positiv kontrollbrønn som bare inneholdt bakterier uten ekstraktet. Etter anaerob inkubering ved 37°C i 24 timer, ble bakterievekst inspisert visuelt. MIC-verdiene ble registrert som de laveste konsentrasjonene som forårsaket en hemming av bakterieveksten. Alle følgende eksperimenter ble utført før og etter behandling av P. gingivalis isolater med sub-inhiberende konsentrasjoner (0,5 MIC) av røkelsesekstraktet.

4.10. Bakterievekstkurve P. gingivalis isolater ble dyrket i blodagarplater, supplert med 5 % saueblod, hemin (5 μg/mL) og vitamin K1 (0,5 μg/mL), i 5-7 dager under anaerobe forhold ved 37° C [43]. Deretter ble en enkelt koloni av hvert isolat inokulert i BHI-buljong, inneholdende hemin (5 µg/ml) og vitamin K1 (1 µg/ml), og dyrket anaerobt i 24 timer. Verdiene for optisk tetthet (OD) ved 600 nm ble detektert hver 2. time. ved bruk av UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu, Japan), og vekstkurvene ble konstruert ved å plotte log OD mot prøvetakingstiden (timer).

4.11. Måling av nukleinsyrelekkasje Frigjøringen av nukleinsyrer fra bakteriecellene ble målt som beskrevet tidligere. P. gingivalis-isolater, i log-fase, ble sentrifugert og pellets ble resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS), og inkubert under anaerobe forhold. Frigjøringen av cellulære nukleinsyrer ble målt til forskjellige tider på 0, 1, 2 og 4 timer. gjennom å måle absorbansen ved 260 nm ved bruk av et 1800 UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu, Japan).

4.12. Antibiofilmaktivitet av røkelsesekstrakt

Det ble utført som tidligere beskrevet. Kort fortalt ble 100 µL P. gingivalis-suspensjoner inokulert og dyrket i en 96-brønners mikrotitreringsplate ved anaerobe forhold ved 37 °C. Etter inkubering i 72 timer, ble de ikke-adherente cellene fjernet via vasking med PBS, og de fikk tørke i 1 time. Biofilmene ble farget med en løsning av 0,1 % krystallfiolett og prøvene ble vasket med destillert vann. For kvantitativ analyse av biofilmproduksjon ble 125 µL 30 % eddiksyre tilsatt og OD ved 492 nm ble målt ved bruk av ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Østerrike). Prosentandelen av biofilmreduksjon ble beregnet ved å bruke formelen:

% reduksjon av biofilmdannelse=(OD ubehandlet-OD behandlet)/(OD ubehandlet) x 100 Måling av de ekstracellulære polysakkaridene Polysakkaridene funnet i den ekstracellulære polymere substansen (EPS) i den dannede biofilmen ble estimert ved bruk av fenol-svovelsyremetoden [ 43]. Kort fortalt ble mikrotitreringsplater, etter 3 dager med biofilmdannelse av P. gingivalis-isolater, vasket med PBS for å fjerne de frittflytende bakteriene og lufttørket. Deretter ble 40 µL sterilt vann pluss 40 µL 6 % fenolløsning, etterfulgt av 200 µL 97 % svovelsyre tilsatt til hver brønn. Platene ble deretter stående ved romtemperatur i 30 minutter og antall polysakkarider i den dannede biofilmen ble bestemt ved å måle absorbansen ved en OD på 490 nm ved bruk av ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Østerrike). Vi brukte forskjellige glukosekonsentrasjoner (0, 5, 10, 20 og 100 mg/L) som standard for å konvertere OD-verdiene til polysakkaridkonsentrasjoner.

4.14. Bakteriell celleoverflate hydrofobicitet

Den bakterielle hydrofobisiteten ble vurdert ved bruk av hydrokarbon-xylen-testen. Kort fortalt ble P. gingivalis-isolater dyrket anaerobt og pellets samlet etter sentrifugering ble resuspendert i fosfat-urea-magnesiumsulfatbuffer (PUM-buffer, pH 6,9). Deretter ble volumer på 0,3, 0,9, 1,2 og 1,8 ml n-heksan tilsatt til 4,8 ml av bakteriesuspensjonen. Blandingene fikk stå i 2 timer og den vandige fasen ble forsiktig separert. Absorbansen til de testede isolatene som forble i den vandige fasen ble målt ved 540 nm. HI ble identifisert med følgende ligning:

HI=(A540-kontroll-A540-test)/(A540-kontroll) 4.15. Undersøkelse av biofilmmorfologi med lysmikroskop og SEM Den ble utført i henhold til Qi et al. Kort fortalt ble to grupper av dekkglass oversvømmet med P. gingivalis-isolater (med og uten røkelsesekstrakt) og de ble stående i tre dager under anaerobe forhold for å la isolatene danne biofilmer. Den første gruppen av de dannede biofilmene av P. gingivalis-isolater ble visualisert med et lysfeltmikroskop (Labomed, Amerika) ved bruk av 100× forstørrelse etter farging med krystallfiolett. Den andre gruppen av de dannede biofilmene ble skylt med PBS og nedsenket i 2,5% glutaraldehydløsning i 24 timer ved 4°C. Deretter ble de sekvensielt dehydrert ved bruk av en serie etanol; konsentrasjoner fra 30 % til 100 %, la tørke og sputterbelagt med gull for undersøkelse med SEM (Hitachi, Japan).

4.16. qRT-PCR Relativt genuttrykk av fimA-, hagA-, hagB-, rgpA- og kgp-gener ble undersøkt ved bruk av qRT-PCR. De brukte primerne er oppført i tabell S1 og 16S rRNA-genet var husholdningsgenet eller den endogene kontrollen. Alle eksperimentene ble utført tre ganger og resultatverdiene ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Forsterkningen ble utført med Power SYBR® Green mastermix (Thermo SCIENTIFIC, USA) ved bruk av Rotor-Gene Q5 plex-instrument (Qiagen, Tyskland). Det relative genuttrykket ble bestemt ved å bruke metoden til 2-ΔΔCt ved å bruke de ubehandlede isolatene som kontrollprøver (ekspresjonen ble satt til 1). Endringer i genuttrykket med ≥ 2 ganger (økt eller redusert) ble ansett for å være statistisk signifikant