Антибактериальная и антибиопленочная активность экстракта ладана в отношении Porphyromonas Gingivalis

Исследование проведено на 30 соматически здоровых пациентах обоего пола в возрасте от 25 до 50 лет с диагнозом хронический пародонтит средней и тяжелой степени (пародонтит III стадии б), отобранных из клиники пародонтологии стоматологического факультета, г. Университет Танта

Пробы жидкости десневой борозды (GCF) собирали из карманов глубиной ≥ 5 мм и с положительным кровотечением при зондировании (активное заболевание) бумажным штифтом. Образцы были получены из пародонтальных карманов после удаления наддесневого налета с зубов, из которых были взяты образцы. Затем образцы поддесневого налета инокулировали в 2 мл бульона с сердечно-мозговой инфузией (BHI) с добавлением 5 мкг/мл гемина и 1 мкг/мл менадиона (витамина К1). Затем их разводили и культивировали на кровяном агаре с добавлением 5% овечьей крови, гемина (5 мкг/мл) и витамина К1 (0,5 мкг/мл). Эти планшеты инкубировали дважды в течение 7-10 дней при 37°С в анаэробной атмосфере. Выращенные бактерии были окончательно отобраны на основе их цвета, размера и формы. Черные пигментированные колонии и грамотрицательные палочки (при микроскопическом исследовании) исследовали с помощью флуоресцентного теста с использованием длинноволнового УФ-света. Отсутствие флуоресценции отличает P. gingivalis от других анаэробных черных пигментированных грамотрицательных палочек. Затем идентификацию изолятов P. gingivalis подтверждали с использованием API 20A (BioMérieux, Франция).

4.8. Антибактериальный скрининг проводили методом диффузии в агар [40]. Вкратце, бактериальную суспензию распределяли на поверхности чашек с кровяным агаром, с добавлением 5 % овечьей крови, 1 % (об./об.) гемина и 1 % (об./об.) витамина К1, затем стерилизованные 6-миллиметровые чистые диски из фильтровальной бумаги пропитывали 25 мкл экстракта живицы ладана с различной концентрацией от 0,5 до 1000 мкг/мл. Диски, загруженные 10% ДМСО, использовали в качестве отрицательного контроля, а тетрациклиновый диск (30 мкг) использовали в качестве положительного контроля. Все чашки Петри инкубировали в анаэробных условиях при 37°С в течение 48 часов. Были измерены диаметры зоны ингибирования, и концентрации экстракта ладана, которые показали четкие зоны (зона ингибирования) вокруг дисков, считались оказывающими ингибирующее действие на тестируемые бактерии.

4.9. Определение значений МИК Величины МИК экстракта ладана в отношении изолятов P. gingivalis оценивали с использованием метода микроразведений в бульоне. Вкратце, культуры P. gingivalis выращивали в течение ночи в бульоне BHI, содержащем гемин (5 мкг/мл) и витамин К1 (1 мкг/мл). Затем в лунки микротитрационного планшета смешивали 100 мкл бактерий плюс 100 мкл серийных разведений (двухкратных) экстракта ладана (начиная с 2000 мкг/мл) в BHI. Каждый планшет для микротитрования имел лунку отрицательного контроля, содержащую BHI без бактерий, и лунку положительного контроля, содержащую только бактерии без экстракта. После анаэробной инкубации при 37°С в течение 24 часов рост бактерий проверяли визуально. Значения MIC регистрировали как самые низкие концентрации, которые вызывали ингибирование роста бактерий. Все следующие эксперименты проводили до и после обработки изолятов P. gingivalis субингибирующими концентрациями (0,5 МИК) экстракта ладана.

4.10. Кривая роста бактерий Изоляты P. gingivalis культивировали в чашках с кровяным агаром с добавлением 5% овечьей крови, гемина (5 мкг/мл) и витамина К1 (0,5 мкг/мл) в течение 5-7 дней в анаэробных условиях при 37°С. С [43]. Затем одну колонию каждого изолята инокулировали в бульон BHI, содержащий гемин (5 мкг/мл) и витамин К1 (1 мкг/мл), и выращивали в анаэробных условиях в течение 24 часов. Значения оптической плотности (OD) при 600 нм определяли каждые 2 часа. с использованием спектрофотометра UV-VIS (Shimadzu, Япония), и кривые роста были построены путем построения графика логарифмической оптической плотности в зависимости от времени отбора проб (часы).

4.11. Измерение утечки нуклеиновых кислот Высвобождение нуклеиновых кислот из бактериальных клеток измеряли, как описано ранее. Изоляты P. gingivalis на логарифмической фазе центрифугировали, осадки ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и инкубировали в анаэробных условиях. Высвобождение клеточных нуклеиновых кислот измеряли в разное время: 0, 1, 2 и 4 часа. путем измерения поглощения при 260 нм с использованием спектрофотометра 1800 UV-VIS (Shimadzu, Япония).

4.12. Антибиопленочная активность экстракта ладана

Это было выполнено, как описано ранее. Вкратце, 100 мкл суспензий P. gingivalis инокулировали и культивировали в 96-луночном микротитровальном планшете в анаэробных условиях при 37 °C. После инкубации в течение 72 часов неприлипшие клетки удаляли промыванием PBS и оставляли для сушки на 1 час. Биопленки окрашивали 0,1% раствором кристаллического фиолетового, образцы промывали дистиллированной водой. Для количественного анализа продукции биопленки добавляли 125 мкл 30% уксусной кислоты и измеряли OD при 492 нм с помощью ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Австрия). Процент уменьшения биопленки рассчитывали по формуле:

% снижения образования биопленки = (OD необработанная-OD обработанная)/(OD необработанная) x 100 Измерение внеклеточных полисахаридов Полисахариды, обнаруженные во внеклеточном полимерном веществе (EPS) сформированной биопленки, оценивали с использованием фенол-сернокислотного метода [ 43]. Вкратце, планшеты для микротитрования после 3 дней образования биопленки изолятами P. gingivalis промывали PBS для удаления свободно плавающих бактерий и сушили на воздухе. Затем в каждую лунку добавляли 40 мкл стерильной воды плюс 40 мкл 6% раствора фенола, а затем 200 мкл 97% серной кислоты. Затем планшеты оставляли при комнатной температуре на 30 мин и определяли количество полисахаридов в образовавшейся биопленке путем измерения оптической плотности при OD 490 нм с помощью ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Австрия). Мы использовали различные концентрации глюкозы (0, 5, 10, 20 и 100 мг/л) в качестве стандарта для преобразования значений OD в концентрации полисахаридов.

4.14. Гидрофобность поверхности бактериальной клетки

Бактериальную гидрофобность оценивали с помощью углеводородно-ксилолового теста. Вкратце, изоляты P. gingivalis культивировали в анаэробных условиях, а осадки, собранные после центрифугирования, ресуспендировали в фосфатно-мочевино-магнийсульфатном буфере (буфер PUM, pH 6,9). Затем к 4,8 мл бактериальной взвеси добавляли 0,3, 0,9, 1,2 и 1,8 мл н-гексана. Смеси оставляли на 2 часа и осторожно отделяли водную фазу. Поглощение тестируемых изолятов, оставшихся в водной фазе, измеряли при 540 нм. HI определяли по следующему уравнению:

HI=(A540 контроль-A540 тест)/(A540 контроль) 4.15. Исследование морфологии биопленки с помощью светового микроскопа и СЭМ проводили согласно Qi et al. Вкратце, две группы покровных стекол заливали изолятами P. gingivalis (с экстрактом ладана и без него) и оставляли на три дня в анаэробных условиях, чтобы изоляты могли образовать биопленки. Первую группу биопленок, сформированных изолятами P. gingivalis, визуализировали в светлопольном микроскопе (Labomed, Америка) при 100-кратном увеличении после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Вторую группу образовавшихся биопленок промывали с помощью PBS и погружали в 2,5% раствор глутарового альдегида на 24 ч при 4°С. Затем их последовательно обезвоживали, используя серию этанола; концентрации в диапазоне от 30% до 100%, дать высохнуть и покрыть напылением золота для исследования с помощью СЭМ (Hitachi, Япония).

4.16. qRT-PCR Относительную экспрессию генов fimA, hagA, hagB, rgpA и kgp исследовали с помощью qRT-PCR. Используемые праймеры перечислены в таблице S1, а ген 16S рРНК представлял собой ген домашнего хозяйства или эндогенный контроль. Все эксперименты проводили трижды, а значения результатов выражали как среднее значение ± стандартное отклонение (SD). Амплификацию проводили мастер-миксом Power SYBR® Green (Thermo SCIENTIFIC, США) на приборе Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Германия). Относительную экспрессию гена определяли методом 2-ΔΔCt с использованием необработанных изолятов в качестве контрольных образцов (его экспрессию устанавливали равной 1). Статистически значимыми считались изменения экспрессии генов в ≥ 2 раза (увеличение или снижение).