Attività antibatterica e anti-biofilm dell'estratto di incenso contro Porphyromonas Gingivalis

Lo studio è stato condotto su 30 pazienti sistemicamente sani di entrambi i sessi di età compresa tra i 25 e i 50 anni, con diagnosi di parodontite cronica da moderata a grave (parodontite di grado III stadio b), e selezionati dalla clinica di Parodontologia, Facoltà di Odontoiatria, Università Tanta

I campioni di fluido crevicolare gengivale (GCF) sono stati prelevati da tasche con profondità ≥ 5 mm e sanguinamento positivo al sondaggio (malattia attiva) con una punta di carta. I campioni sono stati prelevati dalle tasche parodontali dopo aver rimosso la placca sopragengivale dai denti da campionare. I campioni di placca sottogengivale sono stati quindi inoculati in 2 ml di brodo di infusione cuore-cervello (BHI) integrato con 5 μg/ml di emina e 1 μg/ml di menadione (vitamina K1). Sono stati quindi diluiti e coltivati ​​su agar sangue integrato con il 5% di sangue di montone, emina (5 μg/mL) e vitamina K1 (0,5 μg/mL). Queste piastre sono state incubate in duplicato per 7-10 giorni a 37°C in atmosfera anaerobica. I batteri cresciuti sono stati infine selezionati in base al loro colore, dimensione e forma. Le colonie pigmentate di nero ei bastoncini Gram-negativi (se esaminati al microscopio) sono stati esaminati mediante un test di fluorescenza utilizzando luce UV a onde lunghe. L'assenza di fluorescenza distingue tra P. gingivalis e altri bastoncini Gram-negativi anaerobi, pigmentati di nero. L'identificazione degli isolati di P. gingivalis è stata quindi confermata utilizzando API 20A (BioMérieux, Francia).

4.8. Screening antibatterico È stato eseguito utilizzando il metodo di diffusione dell'agar [40]. In breve, la sospensione batterica è stata distribuita sulle superfici della piastra di agar sangue addizionata con il 5% di sangue di montone, l'1% (v/v) di emina e l'1% (v/v) di vitamina K1, quindi i dischi sterilizzati di carta da filtro da 6 mm sono stati impregnati con 25 µl di estratto di oleoresina di incenso con diverse concentrazioni che vanno da 0,5 a 1000 µg/ml. I dischi caricati con DMSO al 10% sono stati usati come controlli negativi e il disco di tetraciclina (30 µg) è stato usato come controllo positivo. Tutte le piastre Petri sono state incubate anaerobicamente a 37°C per 48 ore. Sono stati misurati i diametri delle zone di inibizione e si è ritenuto che le concentrazioni dell'estratto di incenso che mostravano zone chiare (zone di inibizione) attorno ai dischi avessero un effetto inibitorio sui batteri testati.

4.9. Determinazione dei valori MIC I valori MIC dell'estratto di incenso rispetto agli isolati di P. gingivalis sono stati stimati utilizzando il metodo della microdiluizione in brodo. In breve, le colture di P. gingivalis sono state coltivate durante la notte in brodo BHI contenente emina (5 µg/mL) e vitamina K1 (1 µg/mL). Quindi, 100 µL di batteri più 100 µL di diluizioni seriali (raddoppie) dell'estratto di incenso (a partire da 2000 µg/mL) in BHI sono stati miscelati nei pozzetti della piastra di microtitolazione. Ciascuna piastra di microtitolazione aveva un pozzetto di controllo negativo contenente BHI senza batteri e un pozzetto di controllo positivo contenente solo batteri senza l'estratto. Dopo incubazione anaerobica a 37°C per 24 ore, la crescita batterica è stata ispezionata visivamente. I valori MIC sono stati registrati come le concentrazioni più basse che hanno causato un'inibizione della crescita batterica. Tutti i seguenti esperimenti sono stati eseguiti prima e dopo il trattamento di isolati di P. gingivalis con concentrazioni sub-inibitorie (0,5 MIC) dell'estratto di incenso.

4.10. Curva di crescita batterica Gli isolati di P. gingivalis sono stati coltivati ​​in piastre di agar sangue, integrate con il 5% di sangue di montone, emina (5 μg/mL) e vitamina K1 (0,5 μg/mL), per 5-7 giorni in condizioni anaerobiche a 37° C [43]. Quindi, una singola colonia di ciascun isolato è stata inoculata in brodo BHI, contenente emina (5 µg/mL) e vitamina K1 (1 µg/mL), e coltivata anaerobicamente per 24 ore. I valori di densità ottica (OD) a 600 nm sono stati rilevati ogni 2 ore. utilizzando lo spettrofotometro UV-VIS (Shimadzu, Giappone) e le curve di crescita sono state costruite tracciando il log OD rispetto al tempo di campionamento (ore).

4.11. Misurazione della perdita di acido nucleico Il rilascio di acidi nucleici dalle cellule batteriche è stato misurato come descritto in precedenza. Gli isolati di P. gingivalis, in fase logaritmica, sono stati centrifugati e i pellet sono stati risospesi in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e incubati in condizioni anaerobiche. Il rilascio di acidi nucleici cellulari è stato misurato in tempi diversi di 0, 1, 2 e 4 ore. misurando l'assorbanza a 260 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-VIS 1800 (Shimadzu, Giappone).

4.12. Attività antibiofilm dell'estratto di incenso

È stato eseguito come descritto in precedenza. In breve, 100 µL di sospensioni di P. gingivalis sono state inoculate e coltivate in una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti in condizioni anaerobiche a 37 °C. Dopo incubazione per 72 ore, le cellule non aderenti sono state rimosse mediante lavaggio con PBS e sono state lasciate asciugare per 1 ora. I biofilm sono stati colorati con una soluzione di cristalvioletto allo 0,1% e i campioni sono stati lavati con acqua distillata. Per l'analisi quantitativa della produzione di biofilm, sono stati aggiunti 125 μL di acido acetico al 30% e l'OD a 492 nm è stato misurato utilizzando ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Austria). La percentuale di riduzione del biofilm è stata calcolata utilizzando la formula:

% di riduzione della formazione del biofilm=(OD non trattato-OD trattato)/(OD non trattato) x 100 Misurazione dei polisaccaridi extracellulari I polisaccaridi presenti nella sostanza polimerica extracellulare (EPS) del biofilm formatosi sono stati stimati utilizzando il metodo dell'acido fenolo-solforico [ 43]. In breve, le piastre di microtitolazione, dopo 3 giorni di formazione del biofilm da parte degli isolati di P. gingivalis, sono state lavate con PBS per rimuovere i batteri liberi e asciugate all'aria. Quindi, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 40 µL di acqua sterile più 40 µL di soluzione di fenolo al 6%, seguiti da 200 µL di acido solforico al 97%. Le piastre sono state quindi lasciate a temperatura ambiente per 30 minuti e il numero di polisaccaridi nel biofilm formato è stato determinato misurando l'assorbanza a un diametro esterno di 490 nm utilizzando ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Austria). Abbiamo utilizzato diverse concentrazioni di glucosio (0, 5, 10, 20 e 100 mg/L) come standard per convertire i valori di OD in concentrazioni di polisaccaridi.

4.14. Idrofobicità della superficie delle cellule batteriche

L'idrofobicità batterica è stata valutata mediante il test dell'idrocarburo-xilene. In breve, gli isolati di P. gingivalis sono stati coltivati ​​anaerobicamente e i pellet raccolti dopo la centrifugazione sono stati risospesi in tampone fosfato urea magnesio solfato (tampone PUM, pH 6,9). Quindi, volumi di 0,3, 0,9, 1,2 e 1,8 mi di n-esano sono stati aggiunti a 4,8 mi della sospensione batterica. Le miscele sono state lasciate per 2 ore e la fase acquosa è stata cautamente separata. L'assorbanza degli isolati testati rimasti nella fase acquosa è stata misurata a 540 nm. HI è stato identificato dalla seguente equazione:

HI=(A540 controllo-A540 test)/(A540 controllo) 4.15. Esame della morfologia del biofilm mediante microscopio ottico e SEM È stato effettuato secondo Qi et al. In breve, due gruppi di vetrini coprioggetto sono stati inondati con isolati di P. gingivalis (con e senza estratto di incenso) e sono stati lasciati per tre giorni in condizioni anaerobiche per consentire agli isolati di formare biofilm. Il primo gruppo di biofilm formati dagli isolati di P. gingivalis è stato visualizzato da un microscopio a campo chiaro (Labomed, America) utilizzando un ingrandimento 100 × dopo la colorazione con cristalvioletto. Il secondo gruppo di biofilm formati è stato lavato usando PBS e immerso in una soluzione di glutaraldeide al 2,5% per 24 ore a 4°C. Quindi, sono stati disidratati in sequenza utilizzando una serie di etanolo; concentrazioni comprese tra il 30% e il 100%, lasciate essiccare e sputterizzate con oro per l'esame al SEM (Hitachi, Giappone).

4.16. qRT-PCR L'espressione genica relativa dei geni fimA, hagA, hagB, rgpA e kgp è stata esaminata mediante qRT-PCR. I primer usati sono elencati nella Tabella S1 e il gene 16S rRNA era il gene housekeeping o controllo endogeno. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti tre volte e i valori dei risultati sono stati espressi come media ± deviazione standard (DS). L'amplificazione è stata effettuata mediante master mix Power SYBR® Green (Thermo SCIENTIFIC, USA) utilizzando lo strumento Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Germania). L'espressione genica relativa è stata determinata utilizzando il metodo di 2-ΔΔCt utilizzando gli isolati non trattati come campioni di controllo (la sua espressione è stata impostata su 1). I cambiamenti nell'espressione genica con ≥ 2 volte (aumento o diminuzione) sono stati considerati statisticamente significativi