Atividade Antibacteriana e Antibiofilme do Extrato de Olíbano Contra Porphyromonas Gingivalis

O estudo foi realizado em 30 pacientes sistemicamente saudáveis ​​de ambos os sexos com idade variando de 25 a 50 anos, diagnosticados com periodontite crônica moderada a grave (grau III estágio b periodontite), e selecionados da clínica de Periodontologia, Faculdade de Odontologia, Universidade de Tanta

Amostras de fluido crevicular gengival (GCF) foram coletadas de bolsas com ≥ 5 mm de profundidade e sangramento positivo à sondagem (doença ativa) com uma ponta de papel. As amostras foram obtidas das bolsas periodontais após a remoção da placa supragengival dos dentes a serem amostrados. As amostras de placa subgengival foram então inoculadas em 2 ml de caldo de infusão de cérebro e coração (BHI) suplementado com 5 μg/mL de hemina e 1 μg/mL de menadiona (vitamina K1). Em seguida, foram diluídos e cultivados em ágar sangue suplementado com 5% de sangue de carneiro, hemina (5 μg/mL) e vitamina K1 (0,5 μg/mL). Estas placas foram incubadas em duplicado durante 7-10 dias a 37 °C numa atmosfera anaeróbica. As bactérias cultivadas foram finalmente selecionadas com base em sua cor, tamanho e forma. As colônias de pigmentação negra e bastonetes Gram-negativos (quando examinados microscopicamente) foram examinados por um teste de fluorescência usando luz ultravioleta de onda longa. A ausência de fluorescência distingue entre P. gingivalis e outros bacilos Gram-negativos anaeróbicos, de pigmentação preta. A identificação de isolados de P. gingivalis foi então confirmada usando API 20A (BioMérieux, França).

4.8. Triagem antibacteriana Foi realizada pelo método de difusão em ágar [40]. Em resumo, a suspensão bacteriana foi distribuída em superfícies de placas de ágar sangue suplementadas com 5% de sangue de ovelha, 1% (v/v) de hemina e 1% (v/v) de vitamina K1, depois discos de papel de filtro em branco esterilizados de 6 mm foram impregnados com 25 µl de extrato de oleorresina de incenso com diferentes concentrações variando de 0,5 a 1000 µg/ml. Discos carregados com 10% de DMSO foram usados ​​como controle negativo e disco de tetraciclina (30 µg) foi usado como controle positivo. Todas as placas de Petri foram incubadas anaerobicamente a 37°C por 48 horas. Os diâmetros da zona de inibição foram medidos e as concentrações de extrato de olíbano que mostraram zonas claras (zona de inibição) ao redor dos discos foram consideradas como tendo um efeito inibitório nas bactérias testadas.

4.9. Determinação dos valores de MIC Os valores de MIC do extrato de incenso contra isolados de P. gingivalis foram estimados usando o método de microdiluição em caldo. Resumidamente, as culturas de P. gingivalis foram cultivadas durante a noite em caldo BHI contendo hemina (5 µg/mL) e vitamina K1 (1 µg/mL). Em seguida, 100 µL de bactérias mais 100 µL de diluições seriadas (duas vezes) do extrato de olíbano (a partir de 2000 µg/mL) em BHI foram misturados nos poços da placa de microtitulação. Cada placa de microtitulação tinha um poço de controle negativo contendo BHI sem bactérias e um poço de controle positivo contendo apenas bactérias sem o extrato. Após incubação anaeróbia a 37°C por 24 horas, o crescimento bacteriano foi inspecionado visualmente. Os valores MIC foram registrados como as concentrações mais baixas que causaram uma inibição do crescimento bacteriano. Todos os experimentos a seguir foram realizados antes e depois do tratamento de isolados de P. gingivalis com concentrações sub-inibitórias (0,5 MIC) do extrato de olíbano.

4.10. Curva de crescimento bacteriano Isolados de P. gingivalis foram cultivados em placas de ágar sangue, suplementadas com 5% de sangue de ovelha, hemina (5 μg/mL) e vitamina K1 (0,5 μg/mL), por 5-7 dias sob condições anaeróbicas a 37° C [43]. Em seguida, uma única colônia de cada isolado foi inoculada em caldo BHI, contendo hemina (5 µg/mL) e vitamina K1 (1 µg/mL), e cultivada anaerobicamente por 24 horas. Os valores de densidade óptica (OD) a 600 nm foram detectados a cada 2 horas. usando espectrofotômetro UV-VIS (Shimadzu, Japão), e as curvas de crescimento foram construídas plotando o log OD contra o tempo de amostragem (horas).

4.11. Medição do vazamento de ácido nucleico A liberação de ácidos nucleicos das células bacterianas foi medida conforme descrito anteriormente. Isolados de P. gingivalis, na fase logarítmica, foram centrifugados e os pellets ressuspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubados sob condições anaeróbias. A liberação de ácidos nucleicos celulares foi medida em diferentes tempos de 0, 1, 2 e 4 horas. através da medição da absorbância a 260 nm usando um espectrofotômetro 1800 UV-VIS (Shimadzu, Japão).

4.12. Atividade antibiofilme do extrato de incenso

Foi realizado conforme descrito anteriormente. Resumidamente, 100 µL de suspensões de P. gingivalis foram inoculados e cultivados em uma placa de microtitulação de 96 poços em condições anaeróbicas a 37 °C. Após incubação por 72 horas, as células não aderentes foram removidas por meio de lavagem com PBS e deixadas para secar por 1 hora. Os biofilmes foram corados com solução de cristal violeta 0,1% e as amostras foram lavadas com água destilada. Para análise quantitativa da produção de biofilme, 125 µL de ácido acético a 30% foram adicionados e a OD em 492 nm foi medida usando ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Áustria). A porcentagem de redução do biofilme foi calculada usando a fórmula:

% redução da formação de biofilme=(OD não tratada-OD tratada)/(OD não tratada) x 100 Medição dos polissacarídeos extracelulares Os polissacarídeos encontrados na substância polimérica extracelular (EPS) do biofilme formado foram estimados usando o método do ácido fenol-sulfúrico [ 43]. Em resumo, placas de microtitulação, após 3 dias de formação de biofilme por isolados de P. gingivalis, foram lavadas com PBS para remover as bactérias flutuantes e secas ao ar. Em seguida, 40 µL de água estéril mais 40 µL de solução de fenol 6%, seguidos de 200 µL de ácido sulfúrico 97% foram adicionados a cada poço. As placas foram então deixadas à temperatura ambiente por 30 min e o número de polissacarídeos no biofilme formado foi determinado medindo a absorbância a uma OD de 490 nm usando ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Áustria). Usamos diferentes concentrações de glicose (0, 5, 10, 20 e 100 mg/L) como padrão para converter os valores de OD em concentrações de polissacarídeos.

4.14. Hidrofobicidade da superfície da célula bacteriana

A hidrofobicidade bacteriana foi avaliada pelo teste hidrocarboneto-xileno. Resumidamente, isolados de P. gingivalis foram cultivados anaerobicamente e os pellets coletados após centrifugação foram ressuspensos em tampão fosfato uréia sulfato de magnésio (tampão PUM, pH 6,9). Em seguida, volumes de 0,3, 0,9, 1,2 e 1,8 ml de n-hexano foram adicionados a 4,8 ml da suspensão bacteriana. As misturas foram deixadas durante 2 horas e a fase aquosa foi cuidadosamente separada. A absorbância dos isolados testados que permaneceram na fase aquosa foi medida em 540 nm. O HI foi identificado pela seguinte equação:

HI=(controle A540-teste A540)/(controle A540) 4.15. Exame da morfologia do biofilme por microscópio de luz e SEM Foi realizado de acordo com Qi et al. Resumidamente, dois grupos de lâminas de vidro foram inundados com isolados de P. gingivalis (com e sem extrato de incenso) e foram deixados por três dias em condições anaeróbias para permitir que os isolados formassem biofilmes. O primeiro grupo de biofilmes formados por isolados de P. gingivalis foi visualizado em microscópio de campo claro (Labomed, América) com ampliação de 100x após coloração com cristal violeta. O segundo grupo de biofilmes formados foi lavado com PBS e submerso em solução de glutaraldeído a 2,5% por 24 horas a 4°C. Em seguida, foram desidratados sequencialmente com uma série de etanol; concentrações variando de 30% a 100%, deixado secar e revestido com ouro para exame com SEM (Hitachi, Japão).

4.16. qRT-PCR A expressão gênica relativa dos genes fimA, hagA, hagB, rgpA e kgp foi examinada usando qRT-PCR. Os primers utilizados estão listados na Tabela S1 e o gene 16S rRNA foi o gene housekeeping ou controle endógeno. Todos os experimentos foram realizados três vezes e os valores dos resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DP). A amplificação foi realizada pelo master mix Power SYBR® Green (Thermo SCIENTIFIC, EUA) usando o instrumento Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Alemanha). A expressão gênica relativa foi determinada usando o método de 2-ΔΔCt usando os isolados não tratados como amostras de controle (sua expressão foi ajustada para 1). Alterações na expressão gênica com ≥ 2 vezes (aumentadas ou diminuídas) foram consideradas estatisticamente significativas