Suitsukeuutteen antibakteerinen ja biofilmiä estävä vaikutus Porphyromonas Gingivalista vastaan

Tutkimus tehtiin 30:lle systeemisesti terveelle potilaalle molemmista sukupuolista, heidän ikänsä vaihtelivat 25–50-vuotiaista, joilla oli diagnosoitu keskivaikea tai vaikea krooninen parodontiitti (aste III b periodontiitti) ja jotka valittiin Hammaslääketieteellisen tiedekunnan parodontologian klinikalta. Tantan yliopisto

Gingival crevicular -nestenäytteet (GCF) kerättiin taskuista, joiden syvyys oli ≥ 5 mm ja joissa oli positiivista verenvuotoa paperikärjen koetessa (aktiivinen sairaus). Näytteet otettiin periodontaalisista taskuista sen jälkeen, kun supragingivaalinen plakki oli poistettu näytteitettävistä hampaista. Subgingivaaliset plakkinäytteet siirrostettiin sitten 2 ml:aan aivosydäninfuusionestettä (BHI), jota oli täydennetty 5 µg/ml hemiinillä ja 1 µg/ml menadionilla (K1-vitamiini). Sitten ne laimennettiin ja viljeltiin veriagarilla, johon oli lisätty 5 % lampaan verta, hemiiniä (5 µg/ml) ja K1-vitamiinia (0,5 µg/ml). Näitä levyjä inkuboitiin kahtena rinnakkaisena 7-10 päivän ajan 37 °C:ssa anaerobisessa ilmakehässä. Kasvatut bakteerit valittiin lopulta niiden värin, koon ja muodon perusteella. Mustapigmentoidut pesäkkeet ja gramnegatiiviset sauvat (mikroskooppisesti tutkittuna) tutkittiin fluoresenssitestillä käyttämällä pitkäaaltoista UV-valoa. Fluoresenssin puuttuminen tekee eron P. gingivaliksen ja muiden anaerobisten, mustapigmentoituneiden, gramnegatiivisten sauvojen välillä. P. gingivalis -isolaattien tunnistaminen vahvistettiin sitten käyttämällä API 20A:ta (BioMérieux, Ranska).

4.8. Antibakteerinen seulonta Se suoritettiin agar-diffuusiomenetelmällä [40]. Lyhyesti sanottuna bakteerisuspensio jaettiin veri-agar-levyjen pinnoille, joihin oli lisätty 5 % lampaan verta, 1 % (v/v) hemiiniä ja 1 % (v/v) K1-vitamiinia, minkä jälkeen steriloidut 6 mm:n tyhjät suodatinpaperilevyt kyllästettiin 25 µl suitsukkeen oleohartsiuutetta eri pitoisuuksilla 0,5 - 1000 µg/ml. Negatiivisina kontrolleina käytettiin levyjä, jotka oli ladattu 10 % DMSO:lla, ja positiivisena kontrollina käytettiin tetrasykliinilevyä (30 ug). Kaikkia petrimaljoja inkuboitiin anaerobisesti 37 °C:ssa 48 tuntia. Estovyöhykkeiden halkaisijat mitattiin ja suitsukeuutteen pitoisuuksilla, jotka osoittivat selkeitä vyöhykkeitä (inhibitioalue) kiekkojen ympärillä, katsottiin olevan estävä vaikutus testattuihin bakteereihin.

4.9. MIC-arvojen määritys Suitsukeuutteen MIC-arvot P. gingivalis -isolaatteja vastaan ​​arvioitiin käyttämällä liemen mikrolaimennusmenetelmää. Lyhyesti, P. gingivalis -viljelmiä kasvatettiin yön yli BHI-liemessä, joka sisälsi hemiiniä (5 ug/ml) ja Kl-vitamiinia (1 ug/ml). Sitten 100 ui bakteereja plus 100 ui sarjalaimennoksia (kaksikertaisia) suitsukeuutetta (alkaen 2000 ug/ml) BHI:ssä sekoitettiin mikrotitrauslevyn kuoppiin. Jokaisella mikrotitrauslevyllä oli negatiivinen kontrollikuoppa, joka sisälsi BHI:tä ilman bakteereja, ja positiivinen kontrollikuoppa, joka sisälsi vain bakteereita ilman uutetta. 24 tunnin anaerobisen inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa bakteerien kasvua tarkasteltiin visuaalisesti. MIC-arvot kirjattiin pienimpinä pitoisuuksina, jotka aiheuttivat bakteerikasvun eston. Kaikki seuraavat kokeet suoritettiin ennen ja jälkeen P. gingivalis -isolaattien käsittelyn suitsukkeenuutetta aliinhiboivilla konsentraatioilla (0,5 MIC).

4.10. Bakteerikasvukäyrä P. gingivalis -isolaatteja viljeltiin veri-agar-maljoilla, joihin oli lisätty 5 % lampaan verta, hemiiniä (5 µg/ml) ja K1-vitamiinia (0,5 µg/ml), 5-7 päivän ajan anaerobisissa olosuhteissa 37°:ssa. C [43]. Sitten yksi pesäke kustakin isolaatista ympättiin BHI-liemeen, joka sisälsi hemiiniä (5 ug/ml) ja Kl-vitamiinia (1 ug/ml), ja kasvatettiin anaerobisesti 24 tuntia. Optisen tiheyden (OD) arvot 600 nm:ssä havaittiin 2 tunnin välein. käyttäen UV-VIS-spektrofotometriä (Shimadzu, Japani), ja kasvukäyrät muodostettiin piirtämällä log OD näytteenottoajan (tuntia) funktiona.

4.11. Nukleiinihappovuodon mittaaminen Nukleiinihappojen vapautuminen bakteerisoluista mitattiin edellä kuvatulla tavalla. P. gingivalis -isolaatit sentrifugoitiin log-faasissa ja pelletit suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) ja inkuboitiin anaerobisissa olosuhteissa. Solujen nukleiinihappojen vapautuminen mitattiin eri ajankohtina 0, 1, 2 ja 4 tuntia. mittaamalla absorbanssi 260 nm:ssä käyttämällä 1800 UV-VIS spektrofotometriä (Shimadzu, Japani).

4.12 Suitsuuutteen antibiofilmiaktiivisuus

Se suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna 100 ui P. gingivalis -suspensioita ympättiin ja viljeltiin 96-kuoppaiselle mikrotitrauslevylle anaerobisissa olosuhteissa 37 °C:ssa. 72 tunnin inkubaation jälkeen kiinnittymättömät solut poistettiin pesemällä PBS:llä ja niiden annettiin kuivua 1 tunti. Biofilmit värjättiin 0,1 % kristalliviolettiliuoksella ja näytteet pestiin tislatulla vedellä. Biofilmin tuotannon kvantitatiivista analyysiä varten lisättiin 125 ui 30-prosenttista etikkahappoa ja OD mitattiin aallonpituudella 492 nm käyttämällä ELISA Auto Reader -laitetta (Sunrise Tecan, Itävalta). Biofilmin vähenemisen prosenttiosuus laskettiin kaavalla:

Biofilmin muodostumisen vähentyminen % = (OD käsittelemätön - OD käsitelty) / (OD käsittelemätön) x 100 Solunulkoisten polysakkaridien mittaus Muodostuneen biofilmin solunulkoisesta polymeeriaineesta (EPS) löydetyt polysakkaridit arvioitiin fenoli-rikkihappomenetelmällä [ 43]. Lyhyesti sanottuna mikrotitrauslevyt pestiin P. gingivalis -isolaateilla 3 päivän biofilmin muodostumisen jälkeen PBS:llä vapaasti kelluvien bakteerien poistamiseksi ja ilmakuivattiin. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 40 ui steriiliä vettä plus 40 ui 6-prosenttista fenoliliuosta ja sen jälkeen 200 ui 97-prosenttista rikkihappoa. Levyt jätettiin sitten huoneenlämpötilaan 30 minuutiksi ja muodostuneessa biofilmissä olevien polysakkaridien lukumäärä määritettiin mittaamalla absorbanssi OD:llä 490 nm käyttämällä ELISA Auto Reader -laitetta (Sunrise Tecan, Itävalta). Käytimme erilaisia ​​glukoosipitoisuuksia (0, 5, 10, 20 ja 100 mg/L) standardina OD-arvojen muuntamiseksi polysakkaridipitoisuuksiksi.

4.14. Bakteerisolun pinnan hydrofobisuus

Bakteerien hydrofobisuus arvioitiin käyttämällä hiilivety-ksyleenitestiä. Lyhyesti, P. gingivalis -isolaatteja viljeltiin anaerobisesti ja sentrifugoinnin jälkeen kerätyt pelletit suspendoitiin uudelleen fosfaattiurea-magnesiumsulfaattipuskuriin (PUM-puskuri, pH 6,9). Sitten 0,3, 0,9, 1,2 ja 1,8 ml:n tilavuudet n-heksaania lisättiin 4,8 ml:aan bakteerisuspensiota. Seokset jätettiin 2 tunniksi ja vesifaasi erotettiin varovasti. Vesifaasiin jääneiden testattujen isolaattien absorbanssi mitattiin 540 nm:ssä. HI tunnistettiin seuraavalla yhtälöllä:

HI=(A540 kontrolli-A540 testi)/(A540 kontrolli) 4.15. Biofilmin morfologian tutkiminen valomikroskoopilla ja SEM:llä Se suoritettiin Qi et al. Lyhyesti sanottuna kaksi lasipeitelevyryhmää täytettiin P. gingivalis -isolaateilla (suitsuuutteen kanssa ja ilman) ja ne jätettiin kolmeksi päiväksi anaerobisiin olosuhteisiin, jotta isolaatit pystyivät muodostamaan biofilmejä. Ensimmäinen ryhmä P. gingivalis -isolaattien muodostamia biofilmejä visualisoitiin kirkaskenttämikroskoopilla (Labomed, Amerikka) käyttämällä 100-kertaista suurennusta kristallivioletilla värjäyksen jälkeen. Toinen muodostuneiden biofilmien ryhmä huuhdeltiin PBS:llä ja upotettiin 2,5-prosenttiseen glutaraldehydiliuokseen 24 tunniksi 4 °C:ssa. Sitten ne kuivattiin peräkkäin käyttämällä sarjaa etanolia; pitoisuudet vaihtelevat 30 %:sta 100 %:iin, annetaan kuivua ja sputteroidaan kullalla SEM-tutkimusta varten (Hitachi, Japani).

4.16. qRT-PCR FimA-, hagA-, hagB-, rgpA- ja kgp-geenien suhteellinen geeniekspressio tutkittiin käyttämällä qRT-PCR:ää. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa S1 ja 16S-rRNA-geeni oli siivousgeeni tai endogeeninen kontrolli. Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa ja tulosarvot ilmaistiin keskiarvona ± standardipoikkeama (SD). Vahvistus suoritettiin Power SYBR® Green -mastersekoituksella (Thermo SCIENTIFIC, USA) käyttäen Rotor-Gene Q5 plex -laitetta (Qiagen, Saksa). Suhteellinen geeniekspressio määritettiin käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää käyttämällä käsittelemättömiä isolaatteja kontrollinäytteinä (sen ilmentyminen asetettiin arvoon 1). Muutoksia geenin ilmentymisessä ≥ 2-kertaisiksi (lisääntyneet tai vähentyneet) pidettiin tilastollisesti merkitsevinä