Activité antibactérienne et anti-biofilm de l'extrait d'encens contre Porphyromonas Gingivalis

L'étude a été menée sur 30 patients systémiquement sains des deux sexes, âgés de 25 à 50 ans, diagnostiqués avec une parodontite chronique modérée à sévère (parodontite de stade III de stade b), et sélectionnés dans la clinique de parodontologie, Faculté de médecine dentaire, Université Tanta

Des échantillons de liquide créviculaire gingival (GCF) ont été prélevés dans des poches ayant une profondeur ≥ 5 mm et un saignement positif au sondage (maladie active) avec une pointe de papier. Des échantillons ont été obtenus à partir des poches parodontales après avoir retiré la plaque supragingivale des dents à échantillonner. Les échantillons de plaque sous-gingivale ont ensuite été inoculés dans 2 ml de bouillon cœur-cerveau (BHI) additionné de 5 μg/mL d'hémine et de 1 μg/mL de ménadione (vitamine K1). Elles ont ensuite été diluées et cultivées sur gélose au sang additionnée de 5 % de sang de mouton, d'hémine (5 μg/mL) et de vitamine K1 (0,5 μg/mL). Ces plaques ont été incubées en double pendant 7 à 10 jours à 37°C dans une atmosphère anaérobie. Les bactéries cultivées ont finalement été sélectionnées en fonction de leur couleur, de leur taille et de leur forme. Les colonies pigmentées en noir et les bâtonnets Gram-négatifs (lorsqu'ils sont examinés au microscope) ont été examinés par un test de fluorescence utilisant une lumière UV à ondes longues. L'absence de fluorescence permet de distinguer P. gingivalis des autres bâtonnets anaérobies, pigmentés en noir et à Gram négatif. L'identification des isolats de P. gingivalis a ensuite été confirmée à l'aide de l'API 20A (BioMérieux, France).

4.8. Dépistage antibactérien Il a été réalisé par la méthode de diffusion sur gélose [40]. En bref, la suspension bactérienne a été distribuée sur des surfaces de plaques de gélose au sang complétées par 5 % de sang de mouton, 1 % (v/v) d'hémine et 1 % (v/v) de vitamine K1, puis des disques de papier filtre vierges de 6 mm stérilisés ont été imprégnés de 25 µl d'extrait d'oléorésine d'encens à différentes concentrations allant de 0,5 à 1000 µg/ml. Des disques chargés avec 10 % de DMSO ont été utilisés comme témoins négatifs et un disque de tétracycline (30 µg) a été utilisé comme témoin positif. Toutes les boîtes de Pétri ont été incubées en anaérobiose à 37°C pendant 48 heures. Les diamètres des zones d'inhibition ont été mesurés et les concentrations d'extrait d'encens qui présentaient des zones claires (zone d'inhibition) autour des disques ont été considérées comme ayant un effet inhibiteur sur les bactéries testées.

4.9. Détermination des valeurs de CMI Les valeurs de CMI de l'extrait d'encens par rapport aux isolats de P. gingivalis ont été estimées en utilisant la méthode de microdilution en bouillon. En bref, des cultures de P. gingivalis ont été cultivées pendant une nuit dans un bouillon BHI contenant de l'hémine (5 µg/mL) et de la vitamine K1 (1 µg/mL). Ensuite, 100 µL de bactéries plus 100 µL de dilutions en série (deux fois) de l'extrait d'encens (à partir de 2000 µg/mL) dans du BHI ont été mélangés dans les puits de la plaque de microtitration. Chaque plaque de microtitration avait un puits de contrôle négatif contenant du BHI sans bactéries et un puits de contrôle positif contenant uniquement des bactéries sans l'extrait. Après incubation anaérobie à 37°C pendant 24 heures, la croissance bactérienne a été inspectée visuellement. Les valeurs de CMI ont été enregistrées comme les concentrations les plus faibles qui ont provoqué une inhibition de la croissance bactérienne. Toutes les expériences suivantes ont été réalisées avant et après le traitement des isolats de P. gingivalis avec des concentrations sous-inhibitrices (0,5 MIC) de l'extrait d'encens.

4.10. Courbe de croissance bactérienne Les isolats de P. gingivalis ont été cultivés dans des plaques de gélose au sang, additionnées de 5 % de sang de mouton, d'hémine (5 μg/mL) et de vitamine K1 (0,5 μg/mL), pendant 5 à 7 jours dans des conditions anaérobies à 37° C [43]. Ensuite, une seule colonie de chaque isolat a été inoculée dans du bouillon BHI, contenant de l'hémine (5 µg/mL) et de la vitamine K1 (1 µg/mL), et cultivée en anaérobiose pendant 24 heures. Les valeurs de densité optique (DO) à 600 nm ont été détectées toutes les 2 heures. en utilisant un spectrophotomètre UV-VIS (Shimadzu, Japon), et les courbes de croissance ont été construites en traçant le log OD par rapport au temps d'échantillonnage (heures).

4.11. Mesure de la fuite d'acide nucléique La libération d'acides nucléiques à partir des cellules bactériennes a été mesurée comme décrit précédemment. Les isolats de P. gingivalis, en phase logarithmique, ont été centrifugés et les culots ont été remis en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et incubés dans des conditions anaérobies. La libération d'acides nucléiques cellulaires a été mesurée à différents moments de 0, 1, 2 et 4 heures. en mesurant l'absorbance à 260 nm à l'aide d'un spectrophotomètre UV-VIS 1800 (Shimadzu, Japon).

4.12. Activité antibiofilm de l'extrait d'encens

Il a été réalisé comme décrit précédemment. En bref, 100 µL de suspensions de P. gingivalis ont été inoculés et cultivés dans une plaque de microtitration à 96 puits dans des conditions anaérobies à 37 °C. Après incubation pendant 72 heures, les cellules non adhérentes ont été éliminées par lavage avec du PBS, et elles ont été laissées sécher pendant 1 heure. Les biofilms ont été colorés à l'aide d'une solution de cristal violet à 0,1 % et les échantillons ont été lavés à l'eau distillée. Pour l'analyse quantitative de la production de biofilm, 125 µL d'acide acétique à 30 % ont été ajoutés et la DO à 492 nm a été mesurée à l'aide d'ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Autriche). Le pourcentage de réduction du biofilm a été calculé à l'aide de la formule :

% de réduction de la formation de biofilm = (OD non traité-OD traité)/(OD non traité) x 100 Mesure des polysaccharides extracellulaires Les polysaccharides trouvés dans la substance polymérique extracellulaire (EPS) du biofilm formé ont été estimés par la méthode phénol-acide sulfurique [ 43]. En bref, les plaques de microtitration, après 3 jours de formation de biofilm par les isolats de P. gingivalis, ont été lavées avec du PBS pour éliminer les bactéries flottantes et séchées à l'air. Ensuite, 40 µL d'eau stérile plus 40 µL de solution de phénol à 6 %, suivis de 200 µL d'acide sulfurique à 97 % ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont ensuite été laissées à température ambiante pendant 30 min et le nombre de polysaccharides dans le biofilm formé a été déterminé en mesurant l'absorbance à une DO de 490 nm à l'aide d'ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Autriche). Nous avons utilisé différentes concentrations de glucose (0, 5, 10, 20 et 100 mg/L) comme standard pour convertir les valeurs de DO en concentrations de polysaccharides.

4.14. Hydrophobicité de la surface des cellules bactériennes

L'hydrophobicité bactérienne a été évaluée à l'aide du test hydrocarbure-xylène. Brièvement, des isolats de P. gingivalis ont été cultivés en anaérobiose et les culots recueillis après centrifugation ont été remis en suspension dans un tampon phosphate urée magnésium sulfate (tampon PUM, pH 6,9). Ensuite, des volumes de 0,3, 0,9, 1,2 et 1,8 ml de n-hexane ont été ajoutés à 4,8 ml de la suspension bactérienne. Les mélanges ont été laissés pendant 2 heures et la phase aqueuse a été soigneusement séparée. L'absorbance des isolats testés qui sont restés dans la phase aqueuse a été mesurée à 540 nm. HI a été identifié par l'équation suivante :

HI=(Témoin A540-Test A540)/(Témoin A540) 4.15. Examen de la morphologie du biofilm au microscope optique et au MEB Il a été réalisé selon Qi et al. En bref, deux groupes de lamelles couvre-objets en verre ont été inondés d'isolats de P. gingivalis (avec et sans extrait d'encens) et ils ont été laissés pendant trois jours dans des conditions anaérobies pour permettre aux isolats de former des biofilms. Le premier groupe de biofilms formés par des isolats de P. gingivalis a été visualisé au microscope à fond clair (Labomed, Amérique) en utilisant un grossissement de 100 fois après coloration au cristal violet. Le deuxième groupe de biofilms formés a été rincé à l'aide de PBS et immergé dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 24 heures à 4 °C. Ensuite, ils ont été séquentiellement déshydratés à l'aide d'une série d'éthanol ; concentrations allant de 30% à 100%, laisser sécher et recouvert d'or par pulvérisation cathodique pour examen au MEB (Hitachi, Japon).

4.16. qRT-PCR L'expression génique relative des gènes fimA, hagA, hagB, rgpA et kgp a été examinée à l'aide de la qRT-PCR. Les amorces utilisées sont répertoriées dans le tableau S1 et le gène de l'ARNr 16S était le gène de ménage ou le contrôle endogène. Toutes les expériences ont été réalisées trois fois et les valeurs des résultats ont été exprimées en moyenne ± écart type (SD). L'amplification a été réalisée par Power SYBR® Green master mix (Thermo SCIENTIFIC, USA) à l'aide de l'instrument Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Allemagne). L'expression relative du gène a été déterminée en utilisant la méthode de 2-ΔΔCt en utilisant les isolats non traités comme échantillons de contrôle (son expression a été fixée à 1). Les changements dans l'expression génique avec ≥ 2 fois (augmentation ou diminution) ont été considérés comme statistiquement significatifs