Działanie przeciwbakteryjne i przeciwbiofilmowe ekstraktu z kadzidła przeciwko Porphyromonas Gingivalis

Badaniem objęto 30 zdrowych ogólnoustrojowo pacjentów obojga płci w wieku od 25 do 50 lat, z rozpoznaniem przewlekłego zapalenia przyzębia o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego (zapalenie przyzębia stopnia III stopnia b), wybranych z Kliniki Periodontologii Wydziału Stomatologicznego, Uniwersytet Tanta

Próbki płynu dziąsłowego (GCF) pobierano z kieszonek o głębokości ≥ 5 mm i dodatnim krwawieniu przy sondowaniu (aktywna choroba) za pomocą bibułki. Próbki pobierano z kieszonek dziąsłowych po usunięciu płytki naddziąsłowej z zębów, z których pobierano próbki. Próbki płytki poddziąsłowej inokulowano następnie do 2 ml bulionu mózgowo-sercowego (BHI) uzupełnionego 5 μg/ml heminy i 1 μg/ml menadionu (witamina K1). Następnie rozcieńczono je i hodowano na agarze z krwią uzupełnionym 5% krwią baranią, heminą (5 μg/ml) i witaminą K1 (0,5 μg/ml). Płytki te inkubowano w dwóch powtórzeniach przez 7-10 dni w temperaturze 37°C w atmosferze beztlenowej. Wyhodowane bakterie zostały ostatecznie wybrane na podstawie ich koloru, wielkości i kształtu. Kolonie z czarnym pigmentem i pałeczki Gram-ujemne (podczas badania mikroskopowego) badano za pomocą testu fluorescencyjnego przy użyciu długofalowego światła UV. Brak fluorescencji odróżnia P. gingivalis od innych beztlenowych, czarnopigmentowanych pałeczek Gram-ujemnych. Następnie potwierdzono identyfikację izolatów P. gingivalis przy użyciu API 20A (BioMérieux, Francja).

4.8. Screening antybakteryjny Wykonano go metodą dyfuzyjno-agarową [40]. W skrócie, zawiesinę bakteryjną rozprowadzano na powierzchniach płytki z agarem z krwią uzupełnioną 5% krwią baranią, 1% (obj./obj.) heminą i 1% (obj./obj.) 25 µl ekstraktu oleożywicy kadzidła o różnych stężeniach w zakresie od 0,5 do 1000 µg/ml. Krążki załadowane 10% DMSO zastosowano jako kontrolę negatywną, a krążek z tetracykliną (30 µg) zastosowano jako kontrolę pozytywną. Wszystkie szalki Petriego inkubowano beztlenowo w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Zmierzono średnice stref zahamowania i uznano, że stężenia ekstraktu z kadzidła, które wykazywały wyraźne strefy (strefa zahamowania) wokół krążków, mają hamujący wpływ na badane bakterie.

4.9. Oznaczanie wartości MIC Wartości MIC ekstraktu z kadzidła w stosunku do izolatów P. gingivalis oszacowano metodą mikrorozcieńczeń w bulionie. Pokrótce, hodowle P. gingivalis hodowano przez noc w bulionie BHI zawierającym heminę (5 µg/ml) i witaminę K1 (1 µg/ml). Następnie 100 µl bakterii plus 100 µl seryjnych rozcieńczeń (dwukrotnych) ekstraktu z kadzidła (począwszy od 2000 µg/ml) w BHI zmieszano w studzienkach płytki do mikromiareczkowania. Każda płytka do mikromiareczkowania miała studzienkę kontroli negatywnej zawierającą BHI bez bakterii i studzienkę kontroli pozytywnej zawierającą tylko bakterie bez ekstraktu. Po beztlenowej inkubacji w temperaturze 37°C przez 24 godziny, wzrost bakterii oceniano wzrokowo. Wartości MIC rejestrowano jako najniższe stężenia, które powodowały zahamowanie wzrostu bakterii. Wszystkie poniższe doświadczenia przeprowadzono przed i po traktowaniu izolatów P. gingivalis stężeniami subinhibicyjnymi (0,5 MIC) ekstraktu z kadzidła.

4.10. Krzywa wzrostu bakterii Izolaty P. gingivalis hodowano na płytkach agarowych z krwią, uzupełnionych 5% krwią baranią, heminą (5 μg/mL) i witaminą K1 (0,5 μg/mL), przez 5-7 dni w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C C [43]. Następnie pojedynczą kolonią każdego izolatu zaszczepiono bulion BHI zawierający heminę (5 µg/ml) i witaminę K1 (1 µg/ml) i hodowano beztlenowo przez 24 godziny. Wartości gęstości optycznej (OD) przy 600 nm wykrywano co 2 godziny. stosując spektrofotometr UV-VIS (Shimadzu, Japonia), a krzywe wzrostu skonstruowano poprzez wykreślenie logarytmu OD w funkcji czasu pobierania próbek (godz.).

4.11. Pomiar wycieku kwasu nukleinowego Uwalnianie kwasów nukleinowych z komórek bakteryjnych mierzono jak opisano wcześniej. Izolaty P. gingivalis w fazie logarytmicznej odwirowano i osady ponownie zawieszono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i inkubowano w warunkach beztlenowych. Uwalnianie komórkowych kwasów nukleinowych mierzono w różnych czasach 0, 1, 2 i 4 godzin. poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm przy użyciu spektrofotometru 1800 UV-VIS (Shimadzu, Japonia).

4.12. Aktywność antybiofilmowa ekstraktu z kadzidła

Odbyło się to zgodnie z wcześniejszym opisem. Pokrótce, 100 µl zawiesiny P. gingivalis zaszczepiono i hodowano na 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po inkubacji przez 72 godziny, nieprzylegające komórki usunięto przez przemycie PBS i pozostawiono do wyschnięcia na 1 godzinę. Biofilmy barwiono 0,1% roztworem fioletu krystalicznego, a próbki przemywano wodą destylowaną. W celu ilościowej analizy wytwarzania biofilmu dodano 125 µl 30% kwasu octowego i zmierzono OD przy 492 nm za pomocą ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Austria). Procent redukcji biofilmu obliczono ze wzoru:

% redukcji tworzenia się biofilmu = (OD nietraktowane-OD traktowane)/(OD nietraktowane) x 100 Pomiar pozakomórkowych polisacharydów Polisacharydy znalezione w pozakomórkowej substancji polimerowej (EPS) utworzonego biofilmu oszacowano przy użyciu metody fenol-kwas siarkowy [ 43]. W skrócie, płytki do mikromiareczkowania, po 3 dniach tworzenia biofilmu przez izolaty P. gingivalis, przemyto PBS w celu usunięcia swobodnie pływających bakterii i wysuszono na powietrzu. Następnie do każdej studzienki dodano 40 µl sterylnej wody plus 40 µl 6% roztworu fenolu, a następnie 200 µl 97% kwasu siarkowego. Płytki następnie pozostawiono w temperaturze pokojowej na 30 minut i określono liczbę polisacharydów w utworzonym biofilmie przez pomiar absorbancji przy OD 490 nm przy użyciu ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Austria). Użyliśmy różnych stężeń glukozy (0, 5, 10, 20 i 100 mg/l) jako wzorców do przeliczenia wartości OD na stężenia polisacharydów.

4.14. Hydrofobowość powierzchni komórek bakteryjnych

Hydrofobowość bakterii oceniano za pomocą testu węglowodorowo-ksylenowego. Pokrótce, izolaty P. gingivalis hodowano w warunkach beztlenowych, a osad zebrany po odwirowaniu ponownie zawieszono w buforze fosforanowo-mocznikowo-siarczanowo-magnezowym (bufor PUM, pH 6,9). Następnie do 4,8 ml zawiesiny bakteryjnej dodano objętości 0,3, 0,9, 1,2 i 1,8 ml n-heksanu. Mieszaniny pozostawiono na 2 godziny i fazę wodną ostrożnie oddzielono. Absorbancję badanych izolatów pozostających w fazie wodnej mierzono przy 540 nm. HI zidentyfikowano za pomocą następującego równania:

HI=(kontrola A540-test A540)/(kontrola A540) 4.15. Badanie morfologii biofilmu za pomocą mikroskopu świetlnego i SEM Przeprowadzono według Qi et al. Pokrótce, dwie grupy szkiełek nakrywkowych zalano izolatami P. gingivalis (z ekstraktem z kadzidła lub bez) i pozostawiono je na trzy dni w warunkach beztlenowych, aby umożliwić utworzenie biofilmów przez izolaty. Pierwszą grupę biofilmów utworzonych przez izolaty P. gingivalis zwizualizowano za pomocą mikroskopu jasnego pola (Labomed, Ameryka) przy 100-krotnym powiększeniu po wybarwieniu fioletem krystalicznym. Drugą grupę utworzonych biofilmów przepłukano PBS i zanurzono w 2,5% roztworze aldehydu glutarowego na 24 godziny w temperaturze 4°C. Następnie kolejno odwodniono je za pomocą serii etanolu; stężeniach w zakresie od 30% do 100%, pozostawiono do wyschnięcia i napylono katodowo złotem do badania SEM (Hitachi, Japonia).

4.16. qRT-PCR Względną ekspresję genów fimA, hagA, hagB, rgpA i kgp zbadano stosując qRT-PCR. Zastosowane startery wymieniono w Tabeli S1, a gen 16S rRNA był genem metabolizmu podstawowego lub kontrolą endogenną. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono trzykrotnie, a wartości wyników wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Amplifikację przeprowadzono za pomocą Master Mix Power SYBR® Green (Thermo SCIENTIFIC, USA) przy użyciu instrumentu Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Niemcy). Względną ekspresję genów określono metodą 2-ΔΔCt stosując nietraktowane izolaty jako próbki kontrolne (jego ekspresję ustalono na 1). Zmiany w ekspresji genów o ≥ 2-krotnym (zwiększeniu lub zmniejszeniu) uznano za istotne statystycznie