Porphyromonas Gingivalis에 대한 유향 추출물의 항균 및 항생물막 활성

이 연구는 중등도에서 중증의 만성 치주염(등급 III 단계 b 치주염)으로 진단된 25세에서 50세 사이의 전신적으로 건강한 남녀 환자 30명을 대상으로 수행되었으며, 탄타 대학교

치은 열구액 샘플(GCF)은 깊이가 5mm 이상이고 페이퍼 포인트로 프로빙(활동성 질병)에서 양성 출혈이 있는 포켓에서 수집되었습니다. 샘플을 채취할 치아에서 치은연상 플라크를 제거한 후 치주낭에서 샘플을 채취했습니다. 이어서 치은연하 플라크 샘플을 5 μg/mL 헤민 및 1 μg/mL 메나디온(비타민 K1)이 보충된 2 ml 뇌심장 주입액(BHI)에 접종했습니다. 그런 다음 희석하고 5% 양 혈액, 헤민(5μg/mL) 및 비타민 K1(0.5μg/mL)이 보충된 혈액 한천에서 배양했습니다. 이들 플레이트를 혐기성 분위기에서 37℃에서 7-10일 동안 이중으로 배양하였다. 성장한 박테리아는 색상, 크기 및 모양에 따라 최종적으로 선택되었습니다. 흑색 색소 콜로니와 그람 음성 간상균(현미경으로 관찰했을 때)을 장파 UV 광을 이용한 형광 시험으로 검사하였다. 형광의 부재는 P. gingivalis와 다른 혐기성, 흑색 색소, 그람 음성 막대를 구별합니다. P. gingivalis 분리물의 식별은 API 20A(BioMérieux, France)를 사용하여 확인되었습니다.

4.8. 항균 스크리닝 한천확산법[40]을 사용하여 수행하였다. 요약하면, 박테리아 현탁액을 5% 양 혈액, 1%(v/v) 헤민 및 1%(v/v) 비타민 K1이 보충된 혈액 한천 플레이트 표면에 분배한 다음 멸균된 6mm 블랭크 여과지 디스크에 0.5 ~ 1000 µg/ml 범위의 다양한 농도를 가진 유향 올레오레진 추출물 25 µl. 10% DMSO가 로드된 디스크를 음성 대조군으로 사용하고 테트라사이클린 디스크(30μg)를 양성 대조군으로 사용했습니다. 모든 페트리 접시는 37°C에서 48시간 동안 혐기적으로 배양되었습니다. 억제대 직경을 측정하고 디스크 주변에 명확한 영역(저해대)을 나타내는 유향 추출물의 농도가 시험된 세균에 대한 억제 효과가 있는 것으로 간주하였다.

4.9. MIC 값 결정 P. gingivalis 분리주에 대한 유향 추출물의 MIC 값은 국물 미량희석 방법을 사용하여 추정되었습니다. 간단히 말해서, P. 진지발리스의 배양물은 헤민(5μg/mL)과 비타민 K1(1μg/mL)을 함유하는 BHI 국물에서 밤새 성장되었습니다. 그런 다음 100µL의 박테리아와 BHI의 유향 추출물(2000µg/mL에서 시작)의 연속 희석액(2배) 100µL를 미세 적정 플레이트의 웰에서 혼합했습니다. 각각의 미세적정 플레이트는 박테리아 없이 BHI를 포함하는 음성 대조군 웰과 추출물 없이 박테리아만 포함하는 양성 대조군 웰을 가졌다. 37℃에서 24시간 동안 혐기 배양한 후, 세균 성장을 육안으로 검사하였다. MIC 값은 박테리아 성장을 억제하는 가장 낮은 농도로 기록되었습니다. 다음의 모든 실험은 유향 추출물의 준억제 농도(0.5 MIC)로 P. 진지발리스 분리주를 처리하기 전과 후에 수행되었습니다.

4.10. 박테리아 성장 곡선 P. gingivalis 분리균을 37°의 혐기성 조건에서 5-7일 동안 5% 양 혈액, 헤민(5 μg/mL) 및 비타민 K1(0.5 μg/mL)이 보충된 혈액 한천 플레이트에서 배양했습니다. 다 [43]. 그런 다음, 각 분리주의 단일 콜로니를 헤민(5 μg/mL)과 비타민 K1(1 μg/mL)이 포함된 BHI 배지에 접종하고 24시간 동안 혐기성으로 성장시켰습니다. 600 nm에서의 광학 밀도(OD) 값은 2시간마다 검출되었습니다. UV-VIS 분광광도계(Shimadzu, Japan)를 사용하여 샘플링 시간(hrs.)에 대한 로그 OD를 플로팅하여 성장 곡선을 구성했습니다.

4.11. 핵산 누출 측정 박테리아 세포로부터의 핵산 방출은 전술한 바와 같이 측정하였다. 대수기에 있는 P. 진지발리스 분리주를 원심분리하고 펠릿을 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁하고 혐기성 조건에서 배양했습니다. 세포 핵산의 방출은 0, 1, 2 및 4시간의 서로 다른 시간에 측정되었습니다. 1800 UV-VIS 분광광도계(Shimadzu, Japan)를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정함으로써.

4.12. 유향 추출물의 항생물막 활성

이전에 설명한대로 수행되었습니다. 간략하게, 100 μL의 P. 진지발리스 현탁액을 접종하고 37°C의 혐기성 조건에서 96웰 미세역가 플레이트에 배양했습니다. 72시간 동안 배양한 후 PBS로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하고 1시간 동안 건조시켰다. 생물막은 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액을 사용하여 염색되었고 샘플은 증류수로 세척되었습니다. 생물막 생산의 정량 분석을 위해 30% 초산 125 μL를 첨가하고 ELISA Auto Reader(Sunrise Tecan, Austria)를 사용하여 492 nm에서 OD를 측정하였다. 생물막 감소 비율은 다음 공식을 사용하여 계산되었습니다.

생물막 형성 감소 % = (OD 미처리 - OD 미처리) x 100 세포외 다당류 측정 형성된 생물막의 세포외 고분자 물질(EPS)에서 발견되는 다당류는 페놀-황산법을 이용하여 추정하였다[ 43]. 요컨대, P. 진지발리스 분리주에 의한 생물막 형성 3일 후 미세 적정 플레이트를 PBS로 세척하여 자유 부유 박테리아를 제거하고 공기 건조했습니다. 그런 다음 멸균수 40µL와 6% 페놀 용액 40µL, 97% 황산 200µL를 각 웰에 첨가했습니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 30분 동안 방치하고 ELISA Auto Reader(Sunrise Tecan, Austria)를 사용하여 490nm의 OD에서 흡광도를 측정하여 형성된 생물막의 다당류 수를 결정했습니다. OD 값을 다당류 농도로 변환하기 위해 다양한 포도당 농도(0, 5, 10, 20 및 100mg/L)를 표준으로 사용했습니다.

4.14. 세균 세포 표면 소수성

박테리아 소수성은 탄화수소-자일렌 테스트를 사용하여 평가되었습니다. 간략히 설명하면, P. 진지발리스 분리주를 혐기적으로 배양하고 원심분리 후 수집한 펠렛을 인산염 요소 황산마그네슘 완충액(PUM 완충액, pH 6.9)에 재현탁했습니다. 그 다음, 0.3, 0.9, 1.2 및 1.8ml 부피의 n-헥산을 4.8ml의 박테리아 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 방치하고 수성상을 조심스럽게 분리하였다. 수성상에 남아있는 시험된 분리물의 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. HI는 다음 방정식으로 확인되었습니다.

HI=(A540 대조군-A540 시험)/(A540 대조군) 4.15. 광학 현미경 및 SEM에 의한 생물막 형태의 조사 Qi et al. 간략하게, 두 그룹의 유리 커버 슬라이드를 P. 진지발리스 분리주(유향 추출물 포함 및 제외)로 가득 채우고 분리주가 생물막을 형성할 수 있도록 혐기성 조건에서 3일 동안 두었습니다. P. gingivalis 분리주에 의해 형성된 생물막의 첫 번째 그룹은 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 100X 배율을 사용하여 명시야 현미경(Labomed, America)으로 가시화되었습니다. 형성된 생물막의 두 번째 그룹은 PBS를 사용하여 세척하고 4°C에서 24시간 동안 2.5% 글루타르알데히드 용액에 담갔다. 그런 다음 일련의 에탄올을 사용하여 순차적으로 탈수했습니다. 30%에서 100% 범위의 농도, 건조시키고 SEM 검사를 위해 금으로 스퍼터 코팅(히타치, 일본).

4.16. qRT-PCR qRT-PCR을 이용하여 fimA, hagA, hagB, rgpA 및 kgp 유전자의 상대적인 유전자 발현을 조사하였다. 사용된 프라이머는 표 S1에 나열되어 있으며 16S rRNA 유전자는 하우스키핑 유전자 또는 내인성 대조군이었습니다. 모든 실험은 3회 실시하였으며 결과값은 평균±표준편차(SD)로 나타내었다. 증폭은 Rotor-Gene Q5 plex 기기(Qiagen, 독일)를 사용하여 Power SYBR® Green master mix(Thermo SCIENTIFIC, USA)로 수행했습니다. 상대 유전자 발현은 처리되지 않은 분리주를 대조군 샘플로 사용하여 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 결정되었습니다(그 발현은 1로 설정됨). ≥ 2배(증가 또는 감소)의 유전자 발현 변화는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.