Antibakteriel og anti-biofilm aktivitet af røgelseekstrakt mod Porphyromonas Gingivalis

Undersøgelsen blev udført på 30 systemisk sunde patienter af begge køn, deres alder varierede fra 25 til 50 år, diagnosticeret med moderat til svær kronisk parodontitis (grad III stadium b paradentose), og udvalgt fra klinikken for Parodontologi, Det Odontologiske Fakultet, Tanta Universitet

Gingival crevicular væskeprøver (GCF) blev indsamlet fra lommer med ≥ 5 mm dybde og positiv blødning ved sondering (aktiv sygdom) med en papirspids. Prøver blev opnået fra parodontale lommer efter fjernelse af supragingival plaque fra tænderne, der skulle prøves. De subgingivale plakprøver blev derefter inokuleret i 2 ml hjernehjerteinfusion (BHI) bouillon suppleret med 5 μg/mL hemin og 1 μg/mL menadion (vitamin K1). De blev derefter fortyndet og dyrket på blodagar suppleret med 5 % fåreblod, hemin (5 μg/mL) og vitamin K1 (0,5 μg/mL). Disse plader blev inkuberet i to eksemplarer i 7-10 dage ved 37 °C i en anaerob atmosfære. De dyrkede bakterier blev til sidst udvalgt ud fra deres farve, størrelse og form. De sortpigmenterede kolonier og gramnegative stænger (når de blev undersøgt mikroskopisk) blev undersøgt ved en fluorescenstest med langbølget UV-lys. Fraværet af fluorescens skelner mellem P. gingivalis og andre anaerobe, sortpigmenterede, gramnegative stave. Identifikationen af ​​P. gingivalis-isolater blev derefter bekræftet under anvendelse af API 20A (BioMérieux, Frankrig).

4.8. Antibakteriel screening Det blev udført ved hjælp af agar-diffusionsmetoden [40]. Kort fortalt blev bakteriesuspension fordelt på blodagarpladeoverflader suppleret med 5 % fåreblod, 1 % (v/v) hemin og 1 % (v/v) vitamin K1, derefter blev steriliserede 6 mm blanke filterpapirskiver imprægneret med 25 µl røgelse oleoresinekstrakt med forskellige koncentrationer fra 0,5 til 1000 µg/ml. Skiver fyldt med 10% DMSO blev brugt som negative kontroller, og tetracyclin-skive (30 µg) blev brugt som en positiv kontrol. Alle petriskåle blev anaerobt inkuberet ved 37°C i 48 timer. Hæmningszonediametre blev målt, og koncentrationerne af røgelseekstrakt, som viste klare zoner (hæmningszone) omkring skiverne, blev anset for at have en hæmmende effekt på de testede bakterier.

4.9. Bestemmelse af MIC-værdier MIC-værdierne af røgelseekstrakt mod P. gingivalis-isolater blev estimeret ved anvendelse af bouillon-mikrofortyndingsmetoden. Kort fortalt blev kulturer af P. gingivalis dyrket natten over i BHI-bouillon indeholdende hemin (5 µg/ml) og vitamin K1 (1 µg/ml). Derefter blev 100 µL bakterier plus 100 µL seriefortyndinger (to gange) af røgelsesekstraktet (startende fra 2000 µg/ml) i BHI blandet i brøndene på mikrotitreringspladen. Hver mikrotitreringsplade havde en negativ kontrolbrønd indeholdende BHI uden bakterier og en positiv kontrolbrønd, der kun indeholdt bakterier uden ekstraktet. Efter anaerob inkubation ved 37°C i 24 timer blev bakterievækst inspiceret visuelt. MIC-værdierne blev registreret som de laveste koncentrationer, der forårsagede en hæmning af bakterievæksten. Alle de følgende eksperimenter blev udført før og efter behandling af P. gingivalis-isolater med sub-inhiberende koncentrationer (0,5 MIC) af røgelsesekstraktet.

4.10. Bakterievækstkurve P. gingivalis isolater blev dyrket i blodagarplader, suppleret med 5 % fåreblod, hemin (5 μg/mL) og vitamin K1 (0,5 μg/mL) i 5-7 dage under anaerobe forhold ved 37° C [43]. Derefter blev en enkelt koloni af hvert isolat inokuleret i BHI-bouillon, indeholdende hemin (5 µg/ml) og vitamin K1 (1 µg/ml) og dyrket anaerobt i 24 timer. De optiske tæthedsværdier (OD) ved 600 nm blev detekteret hver 2. time. under anvendelse af UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu, Japan), og vækstkurverne blev konstrueret ved at plotte log OD mod prøveudtagningstiden (timer).

4.11. Måling af nukleinsyrelækage Frigivelsen af ​​nukleinsyrer fra bakteriecellerne blev målt som beskrevet tidligere. P. gingivalis-isolater, i log-fase, blev centrifugeret, og pellets blev resuspenderet i phosphatpufret saltvand (PBS) og inkuberet under anaerobe betingelser. Frigivelsen af ​​cellulære nukleinsyrer blev målt på forskellige tidspunkter på 0, 1, 2 og 4 timer. gennem måling af absorbansen ved 260 nm under anvendelse af et 1800 UV-VIS spektrofotometer (Shimadzu, Japan).

4.12. Antibiofilmaktivitet af røgelseekstrakt

Det blev udført som tidligere beskrevet. Kort fortalt blev 100 µL P. gingivalis-suspensioner inokuleret og dyrket i en mikrotitreringsplade med 96 brønde ved anaerobe betingelser ved 37 °C. Efter inkubation i 72 timer blev de ikke-adhærente celler fjernet via vask med PBS, og de fik lov til at tørre i 1 time. Biofilmene blev farvet med en opløsning af 0,1% krystalviolet, og prøverne blev vasket med destilleret vand. Til kvantitativ analyse af biofilmproduktion blev 125 µL 30% eddikesyre tilsat, og OD ved 492 nm blev målt ved hjælp af ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Østrig). Procentdelen af ​​biofilmreduktion blev beregnet ved hjælp af formlen:

% reduktion af biofilmdannelse=(OD ubehandlet-OD behandlet)/(OD ubehandlet) x 100 Måling af de ekstracellulære polysaccharider Polysacchariderne fundet i det ekstracellulære polymere stof (EPS) af den dannede biofilm blev estimeret ved hjælp af phenol-svovlsyremetoden [ 43]. Kort fortalt blev mikrotitreringsplader, efter 3 dages biofilmdannelse af P. gingivalis isolater, vasket med PBS for at fjerne de fritflydende bakterier og lufttørret. Derefter blev 40 µL sterilt vand plus 40 µL 6 % phenolopløsning efterfulgt af 200 µL 97 % svovlsyre tilsat til hver brønd. Pladerne blev derefter efterladt ved stuetemperatur i 30 minutter, og antallet af polysaccharider i den dannede biofilm blev bestemt ved at måle absorbansen ved en OD på 490 nm under anvendelse af ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Østrig). Vi brugte forskellige glukosekoncentrationer (0, 5, 10, 20 og 100 mg/L) som standard til at konvertere OD-værdierne til polysaccharidkoncentrationer.

4.14. Bakteriel celleoverflade hydrofobicitet

Den bakterielle hydrofobicitet blev vurderet under anvendelse af carbonhydrid-xylen-testen. Kort fortalt blev P. gingivalis-isolater dyrket anaerobt, og pellets opsamlet efter centrifugering blev resuspenderet i phosphat-urinstof-magnesiumsulfatbuffer (PUM-buffer, pH 6,9). Derefter blev volumener på 0,3, 0,9, 1,2 og 1,8 ml n-hexan tilsat til 4,8 ml af bakteriesuspensionen. Blandingerne henstod i 2 timer, og den vandige fase blev forsigtigt adskilt. Absorbansen af ​​de testede isolater, der forblev i den vandige fase, blev målt ved 540 nm. HI blev identificeret ved følgende ligning:

HI=(A540 kontrol-A540 test)/(A540 kontrol) 4.15. Undersøgelse af biofilmmorfologi ved lysmikroskop og SEM Det blev udført ifølge Qi et al. Kort fortalt blev to grupper af dækglas oversvømmet med P. gingivalis-isolater (med og uden røgelseekstrakt), og de blev efterladt i tre dage under anaerobe forhold for at tillade isolaterne at danne biofilm. Den første gruppe af de dannede biofilm af P. gingivalis isolater blev visualiseret med et lysfeltsmikroskop (Labomed, Amerika) ved anvendelse af 100x forstørrelse efter farvning med krystalviolet. Den anden gruppe af de dannede biofilm blev skyllet under anvendelse af PBS og nedsænket i 2,5% glutaraldehydopløsning i 24 timer ved 4°C. Derefter blev de sekventielt dehydreret under anvendelse af en række ethanol; koncentrationer fra 30% til 100%, lad tørre og sputtercoated med guld til undersøgelse med SEM (Hitachi, Japan).

4.16. qRT-PCR Relativ genekspression af fimA-, hagA-, hagB-, rgpA- og kgp-gener blev undersøgt ved hjælp af qRT-PCR. De anvendte primere er anført i tabel S1, og 16S rRNA-genet var husholdningsgenet eller den endogene kontrol. Alle forsøgene blev udført tre gange, og resultatværdierne blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (SD). Forstærkningen blev udført med Power SYBR® Green mastermix (Thermo SCIENTIFIC, USA) ved brug af Rotor-Gene Q5 plex-instrument (Qiagen, Tyskland). Den relative genekspression blev bestemt under anvendelse af 2-ΔACt-metoden under anvendelse af de ubehandlede isolater som kontrolprøver (dets ekspression blev sat til 1). Ændringer i genekspressionen med ≥ 2 gange (øget eller reduceret) blev anset for at være statistisk signifikant