Antibakteriální a antibiofilmová aktivita extraktu z kadidla proti Porphyromonas Gingivalis

Studie byla provedena na 30 systémově zdravých pacientech obou pohlaví ve věku od 25 do 50 let s diagnostikovanou středně těžkou až těžkou chronickou parodontitidou (paradentóza III. stupně stadia b) a vybraných z kliniky parodontologie Fakulty zubního lékařství, Univerzita Tanta

Vzorky gingivální krevikulární tekutiny (GCF) byly odebrány z kapes majících hloubku ≥ 5 mm a pozitivní krvácení při sondování (aktivní onemocnění) pomocí papírového hrotu. Vzorky byly získány z periodontálních kapes po odstranění supragingiválního plaku ze zubů, které mají být odebrány. Vzorky subgingiválního plaku byly poté naočkovány do 2 ml bujónu mozkové srdeční infuze (BHI) doplněného 5 ug/ml heminu a 1 ug/ml menadionu (vitamín K1). Poté byly zředěny a kultivovány na krevním agaru doplněném 5% ovčí krví, heminem (5 μg/ml) a vitaminem K1 (0,5 μg/ml). Tyto destičky byly inkubovány v duplikátech po dobu 7-10 dnů při 37 °C v anaerobní atmosféře. Pěstované bakterie byly nakonec vybrány na základě jejich barvy, velikosti a tvaru. Černě pigmentované kolonie a gramnegativní tyčinky (při mikroskopickém zkoumání) byly zkoumány fluorescenčním testem za použití dlouhovlnného UV světla. Absence fluorescence rozlišuje mezi P. gingivalis a jinými anaerobními, černě pigmentovanými, gramnegativními tyčinkami. Identifikace izolátů P. gingivalis byla poté potvrzena pomocí API 20A (BioMérieux, Francie).

4.8. Antibakteriální screening Byl proveden agarovou difúzní metodou [40]. Stručně řečeno, bakteriální suspenze byla distribuována na povrchy krevní agarové plotny doplněné 5 % ovčí krve, 1 % (obj./obj.) heminu a 1 % (obj./obj.) vitaminu K1, poté byly sterilizované 6 mm prázdné disky filtračního papíru impregnovány 25 µl kadidlového oleoresinového extraktu s různými koncentracemi v rozmezí od 0,5 do 1000 µg/ml. Disky naplněné 10% DMSO byly použity jako negativní kontroly a tetracyklinový disk (30 ug) byl použit jako pozitivní kontrola. Všechny Petriho misky byly anaerobně inkubovány při 37 °C po dobu 48 hodin. Byly měřeny průměry inhibičních zón a koncentrace extraktu z kadidla, které vykazovaly jasné zóny (inhibiční zóna) kolem disků, byly považovány za mající inhibiční účinek na testované bakterie.

4.9. Stanovení hodnot MIC Hodnoty MIC extraktu z kadidla proti izolátům P. gingivalis byly odhadnuty metodou mikroředění bujónu. Stručně, kultury P. gingivalis byly pěstovány přes noc v BHI bujónu obsahujícím hemin (5 ug/ml) a vitamín Kl (1 ug/ml). Poté bylo v jamkách mikrotitrační destičky smícháno 100 ul bakterií plus 100 ul sériových ředění (dvakrát) extraktu z kadidla (počínaje 2000 ug/ml) v BHI. Každá mikrotitrační destička měla negativní kontrolní jamku obsahující BHI bez bakterií a pozitivní kontrolní jamku obsahující pouze bakterie bez extraktu. Po anaerobní inkubaci při 37 °C po dobu 24 hodin byl vizuálně kontrolován bakteriální růst. Hodnoty MIC byly zaznamenány jako nejnižší koncentrace, které způsobily inhibici růstu bakterií. Všechny následující experimenty byly provedeny před a po ošetření izolátů P. gingivalis subinhibičními koncentracemi (0,5 MIC) extraktu z kadidla.

4.10. Bakteriální růstová křivka Izoláty P. gingivalis byly kultivovány na plotnách s krevním agarem, doplněným 5% ovčí krví, heminem (5 μg/ml) a vitaminem K1 (0,5 μg/ml), po dobu 5-7 dnů za anaerobních podmínek při 37° C [43]. Poté byla jedna kolonie každého izolátu naočkována do BHI bujónu, obsahujícího hemin (5 ug/ml) a vitamín K1 (1 ug/ml), a pěstována anaerobně po dobu 24 hodin. Hodnoty optické hustoty (OD) při 600 nm byly detekovány každé 2 hodiny. za použití UV-VIS spektrofotometru (Shimadzu, Japonsko) a růstové křivky byly zkonstruovány vynesením log OD proti času vzorkování (hod.).

4.11. Měření úniku nukleové kyseliny Uvolňování nukleových kyselin z bakteriálních buněk bylo měřeno, jak bylo popsáno dříve. Izoláty P. gingivalis v log fázi byly odstředěny a pelety byly resuspendovány ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) a inkubovány za anaerobních podmínek. Uvolňování buněčných nukleových kyselin bylo měřeno v různých časech 0, 1, 2 a 4 hodiny. měřením absorbance při 260 nm za použití 1800 UV-VIS spektrofotometru (Shimadzu, Japonsko).

4.12. Antibiofilmová aktivita extraktu z kadidla

Bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve. Stručně řečeno, 100 ul suspenzí P. gingivalis bylo naočkováno a kultivováno na 96jamkové mikrotitrační destičce za anaerobních podmínek při 37 °C. Po inkubaci po dobu 72 hodin byly neadherentní buňky odstraněny promytím PBS a byly ponechány sušit po dobu 1 hodiny. Biofilmy byly obarveny roztokem 0,1% krystalové violeti a vzorky byly promyty destilovanou vodou. Pro kvantitativní analýzu produkce biofilmu bylo přidáno 125 ul 30% kyseliny octové a OD při 492 nm byla měřena pomocí ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Rakousko). Procento snížení biofilmu bylo vypočteno pomocí vzorce:

% snížení tvorby biofilmu=(OD neošetřená-OD upravená)/(OD neošetřená) x 100 Měření extracelulárních polysacharidů Polysacharidy nalezené v extracelulární polymerní látce (EPS) vytvořeného biofilmu byly odhadnuty pomocí metody fenol-kyselina sírová [ 43]. Stručně řečeno, mikrotitrační destičky byly po 3 dnech tvorby biofilmu izoláty P. gingivalis promyty PBS, aby se odstranily volně plovoucí bakterie, a vysušeny na vzduchu. Poté bylo do každé jamky přidáno 40 ul sterilní vody plus 40 ul 6% roztoku fenolu a následně 200 ul 97% kyseliny sírové. Destičky byly poté ponechány při teplotě místnosti po dobu 30 minut a počet polysacharidů ve vytvořeném biofilmu byl stanoven měřením absorbance při OD 490 nm pomocí ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Rakousko). Použili jsme různé koncentrace glukózy (0, 5, 10, 20 a 100 mg/l) jako standard pro převod hodnot OD na koncentrace polysacharidů.

4.14. Hydrofobnost povrchu bakteriálních buněk

Bakteriální hydrofobicita byla hodnocena pomocí uhlovodíkového-xylenového testu. Stručně, izoláty P. gingivalis byly kultivovány anaerobně a pelety shromážděné po centrifugaci byly resuspendovány ve fosfátovém močovino-hořečnatém pufru (pufr PUM, pH 6,9). Poté byly k 4,8 ml bakteriální suspenze přidány objemy 0,3, 0,9, 1,2 a 1,8 ml n-hexanu. Směsi byly ponechány 2 hodiny a vodná fáze byla opatrně oddělena. Absorbance testovaných izolátů, které zůstaly ve vodné fázi, byla měřena při 540 nm. HI byl identifikován podle následující rovnice:

HI=(kontrola A540-test A540)/(kontrola A540) 4.15. Zkoumání morfologie biofilmu světelným mikroskopem a SEM Bylo provedeno podle Qi et al. Stručně, dvě skupiny skleněných krycích sklíček byly zaplaveny izoláty P. gingivalis (s extraktem z kadidla a bez něj) a byly ponechány tři dny v anaerobních podmínkách, aby se umožnilo izolátům vytvořit biofilmy. První skupina vytvořených biofilmů izolátů P. gingivalis byla vizualizována mikroskopem ve světlém poli (Labomed, Amerika) s použitím 100× zvětšení po obarvení krystalovou violetí. Druhá skupina vytvořených biofilmů byla opláchnuta pomocí PBS a ponořena do 2,5% roztoku glutaraldehydu na 24 hodin při 4 °C. Poté byly postupně dehydratovány za použití řady ethanolu; koncentrace v rozmezí od 30 % do 100 %, nechejte zaschnout a nastříkejte zlatem pro vyšetření pomocí SEM (Hitachi, Japonsko).

4.16. qRT-PCR Relativní genová exprese genů fimA, hagA, hagB, rgpA a kgp byla zkoumána pomocí qRT-PCR. Použité primery jsou uvedeny v tabulce S1 a gen 16S rRNA byl provozním genem nebo endogenní kontrolou. Všechny experimenty byly provedeny třikrát a výsledné hodnoty byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). Amplifikace byla provedena pomocí Power SYBR® Green master mix (Thermo SCIENTIFIC, USA) s použitím přístroje Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Německo). Relativní genová exprese byla stanovena pomocí metody 2-ACt s použitím neošetřených izolátů jako kontrolních vzorků (jeho exprese byla nastavena na 1). Změny v genové expresi s ≥ 2násobkem (zvýšené nebo snížené) byly považovány za statisticky významné