Actividad antibacteriana y antibiopelícula del extracto de incienso contra Porphyromonas Gingivalis

El estudio se realizó en 30 pacientes sistémicamente sanos de ambos sexos, con edades entre 25 y 50 años, diagnosticados de periodontitis crónica moderada a severa (periodontitis grado III estadio b), seleccionados de la clínica de Periodoncia de la Facultad de Odontología, Universidad Tanta

Se recogieron muestras de líquido crevicular gingival (GCF) de bolsas que tenían ≥ 5 mm de profundidad y sangrado positivo al sondaje (enfermedad activa) con una punta de papel. Las muestras se obtuvieron de las bolsas periodontales después de retirar la placa supragingival de los dientes a muestrear. Las muestras de placa subgingival se inocularon luego en 2 ml de caldo de infusión de cerebro y corazón (BHI) suplementado con 5 μg/mL de hemina y 1 μg/mL de menadiona (vitamina K1). Luego se diluyeron y se cultivaron en agar sangre suplementado con sangre de carnero al 5 %, hemina (5 μg/mL) y vitamina K1 (0,5 μg/mL). Estas placas se incubaron por duplicado durante 7-10 días a 37 °C en una atmósfera anaerobia. Las bacterias cultivadas finalmente se seleccionaron en función de su color, tamaño y forma. Las colonias pigmentadas de negro y los bacilos Gram-negativos (cuando se examinaron microscópicamente) se examinaron mediante una prueba de fluorescencia utilizando luz ultravioleta de onda larga. La ausencia de fluorescencia distingue entre P. gingivalis y otros bacilos gramnegativos anaerobios pigmentados de negro. Luego se confirmó la identificación de los aislamientos de P. gingivalis utilizando API 20A (BioMérieux, Francia).

4.8. Cribado antibacteriano Se realizó mediante el método de difusión en agar [40]. En resumen, la suspensión bacteriana se distribuyó sobre superficies de placas de agar sangre suplementadas con sangre de carnero al 5 %, hemina al 1 % (v/v) y vitamina K1 al 1 % (v/v), luego se impregnaron discos de papel de filtro en blanco de 6 mm esterilizados con 25 µl de extracto de oleorresina de incienso con diferentes concentraciones que van desde 0,5 a 1000 µg/ml. Los discos cargados con DMSO al 10 % se usaron como controles negativos y el disco de tetraciclina (30 µg) se usó como control positivo. Todas las cajas de Petri se incubaron anaeróbicamente a 37°C durante 48 horas. Se midieron los diámetros de la zona de inhibición y se consideró que las concentraciones de extracto de incienso que mostraban zonas claras (zona de inhibición) alrededor de los discos tenían un efecto inhibidor sobre las bacterias ensayadas.

4.9. Determinación de los valores de MIC Los valores de MIC del extracto de incienso frente a aislamientos de P. gingivalis se estimaron utilizando el método de microdilución en caldo. Brevemente, se cultivaron cultivos de P. gingivalis durante la noche en caldo BHI que contenía hemina (5 µg/mL) y vitamina K1 (1 µg/mL). Luego, se mezclaron en los pozos de la placa de microtitulación 100 µL de bacterias más 100 µL de diluciones seriadas (dos veces) del extracto de incienso (a partir de 2000 µg/mL) en BHI. Cada placa de microtitulación tenía un pozo de control negativo que contenía BHI sin bacterias y un pozo de control positivo que contenía solo bacterias sin el extracto. Después de la incubación anaerobia a 37°C durante 24 horas, se inspeccionó visualmente el crecimiento bacteriano. Los valores de MIC se registraron como las concentraciones más bajas que causaron una inhibición del crecimiento bacteriano. Todos los experimentos siguientes se realizaron antes y después del tratamiento de aislados de P. gingivalis con concentraciones subinhibitorias (0,5 MIC) del extracto de incienso.

4.10. Curva de crecimiento bacteriano Los aislados de P. gingivalis se cultivaron en placas de agar sangre, suplementados con sangre de carnero al 5 %, hemina (5 μg/mL) y vitamina K1 (0,5 μg/mL), durante 5 a 7 días en condiciones anaeróbicas a 37 °C. C [43]. Luego, se inoculó una sola colonia de cada aislamiento en caldo BHI, que contenía hemina (5 µg/mL) y vitamina K1 (1 µg/mL), y se cultivó anaeróbicamente durante 24 horas. Los valores de densidad óptica (DO) a 600 nm se detectaron cada 2 horas. usando un espectrofotómetro UV-VIS (Shimadzu, Japón), y las curvas de crecimiento se construyeron trazando el log OD contra el tiempo de muestreo (hrs.).

4.11. Medición de la fuga de ácido nucleico La liberación de ácidos nucleicos de las células bacterianas se midió como se describió anteriormente. Los aislados de P. gingivalis, en la fase logarítmica, se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron en condiciones anaeróbicas. La liberación de ácidos nucleicos celulares se midió a diferentes tiempos de 0, 1, 2 y 4 horas. midiendo la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro 1800 UV-VIS (Shimadzu, Japón).

4.12. Actividad antibiopelícula del extracto de incienso

Se realizó como se describió anteriormente. Brevemente, se inocularon 100 µl de suspensiones de P. gingivalis y se cultivaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos en condiciones anaeróbicas a 37 °C. Después de la incubación durante 72 horas, las células no adherentes se eliminaron mediante lavado con PBS y se dejaron secar durante 1 hora. Las biopelículas se tiñeron con una solución de cristal violeta al 0,1 % y las muestras se lavaron con agua destilada. Para el análisis cuantitativo de la producción de biopelículas, se añadieron 125 µL de ácido acético al 30 % y se midió la DO a 492 nm usando ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Austria). El porcentaje de reducción del biofilm se calculó mediante la fórmula:

% de reducción de la formación de biopelículas = (OD sin tratar-OD sin tratar)/(OD sin tratar) x 100 Medición de los polisacáridos extracelulares Los polisacáridos encontrados en la sustancia polimérica extracelular (EPS) de la biopelícula formada se estimaron utilizando el método del ácido fenol-sulfúrico [ 43]. En resumen, las placas de microtitulación, después de 3 días de formación de biopelículas por aislamientos de P. gingivalis, se lavaron con PBS para eliminar las bacterias flotantes y se secaron al aire. A continuación, se añadieron a cada pocillo 40 µl de agua estéril más 40 µl de solución de fenol al 6 %, seguidos de 200 µl de ácido sulfúrico al 97 %. Luego, las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y se determinó el número de polisacáridos en la biopelícula formada midiendo la absorbancia a una DO de 490 nm utilizando ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Austria). Usamos diferentes concentraciones de glucosa (0, 5, 10, 20 y 100 mg/L) como estándar para convertir los valores de OD a concentraciones de polisacáridos.

4.14. Hidrofobicidad de la superficie celular bacteriana

La hidrofobicidad bacteriana se evaluó mediante la prueba de hidrocarburo-xileno. Brevemente, los aislados de P. gingivalis se cultivaron anaeróbicamente y los sedimentos recogidos después de la centrifugación se resuspendieron en tampón de sulfato de magnesio urea y fosfato (tampón PUM, pH 6,9). Luego, se agregaron volúmenes de 0,3, 0,9, 1,2 y 1,8 ml de n-hexano a 4,8 ml de la suspensión bacteriana. Las mezclas se dejaron durante 2 horas y la fase acuosa se separó cuidadosamente. La absorbancia de los aislados ensayados que quedaron en fase acuosa se midió a 540 nm. HI fue identificado por la siguiente ecuación:

HI=(Control A540-Prueba A540)/(Control A540) 4.15. Examen de la morfología del biofilm por microscopio óptico y SEM Se llevó a cabo de acuerdo con Qi et al. Brevemente, se inundaron dos grupos de portaobjetos de vidrio con aislados de P. gingivalis (con y sin extracto de incienso) y se dejaron durante tres días en condiciones anaeróbicas para permitir que los aislados formaran biopelículas. El primer grupo de biopelículas formadas por aislamientos de P. gingivalis se visualizó mediante un microscopio de campo claro (Labomed, América) usando un aumento de 100x después de teñir con cristal violeta. El segundo grupo de biopelículas formadas se enjuagó con PBS y se sumergió en una solución de glutaraldehído al 2,5 % durante 24 horas a 4 °C. Luego, se deshidrataron secuencialmente usando una serie de etanol; concentraciones que oscilan entre el 30 % y el 100 %, se deja secar y se recubre con oro para su examen con SEM (Hitachi, Japón).

4.16. qRT-PCR La expresión génica relativa de los genes fimA, hagA, hagB, rgpA y kgp se examinó mediante qRT-PCR. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla S1 y el gen 16S rRNA fue el gen de limpieza o el control endógeno. Todos los experimentos se realizaron tres veces y los valores de los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (DE). La amplificación se llevó a cabo mediante la mezcla maestra Power SYBR® Green (Thermo SCIENTIFIC, EE. UU.) utilizando el instrumento Rotor-Gene Q5 plex (Qiagen, Alemania). La expresión génica relativa se determinó utilizando el método de 2-ΔΔCt utilizando los aislados no tratados como muestras de control (su expresión se fijó en 1). Los cambios en la expresión génica con ≥ 2 veces (aumento o disminución) se consideraron estadísticamente significativos