Antibacteriële en anti-biofilmactiviteit van wierookextract tegen Porphyromonas Gingivalis

De studie werd uitgevoerd bij 30 systemisch gezonde patiënten van beide geslachten, hun leeftijd varieerde van 25 tot 50 jaar oud, gediagnosticeerd met matige tot ernstige chronische parodontitis (graad III stadium b parodontitis), en geselecteerd uit de kliniek voor Parodontologie, Faculteit der Tandheelkunde, Tanta Universiteit

Gingivale creviculaire vloeistofmonsters (GCF) werden verzameld uit pockets met ≥ 5 mm diepte en positieve bloeding bij sonderen (actieve ziekte) met een papieren punt. Monsters werden verkregen uit de parodontale pockets na verwijdering van de supragingivale plaque van de te bemonsteren tanden. De subgingivale plaquemonsters werden vervolgens geïnoculeerd in 2 ml Brain Heart Infusion (BHI) bouillon aangevuld met 5 μg/ml hemine en 1 μg/ml menadion (vitamine K1). Ze werden vervolgens verdund en gekweekt op bloedagar aangevuld met 5% schapenbloed, hemine (5 μg/ml) en vitamine K1 (0,5 μg/ml). Deze platen werden 7-10 dagen in duplo geïncubeerd bij 37°C in een anaërobe atmosfeer. De gekweekte bacteriën werden uiteindelijk geselecteerd op basis van hun kleur, grootte en vorm. De zwart gepigmenteerde kolonies en Gram-negatieve staven (indien microscopisch onderzocht) werden onderzocht door middel van een fluorescentietest met behulp van langgolvig UV-licht. De afwezigheid van fluorescentie maakt onderscheid tussen P. gingivalis en andere anaërobe, zwart gepigmenteerde, Gram-negatieve staafjes. De identificatie van P. gingivalis-isolaten werd vervolgens bevestigd met behulp van API 20A (BioMérieux, Frankrijk).

4.8. Antibacteriële screening Het werd uitgevoerd met behulp van de agar-diffusiemethode [40]. In het kort werd de bacteriesuspensie verdeeld over bloedagarplaatoppervlakken aangevuld met 5% schapenbloed, 1% (v/v) hemine en 1% (v/v) vitamine K1, vervolgens werden gesteriliseerde 6 mm blanco filtreerpapierschijven geïmpregneerd met 25 µl wierook-oleohars-extract met verschillende concentraties van 0,5 tot 1000 µg/ml. Schijven geladen met 10% DMSO werden gebruikt als negatieve controles en tetracyclineschijf (30 µg) werd gebruikt als positieve controle. Alle petrischalen werden anaëroob geïncubeerd bij 37°C gedurende 48 uur. Diameters van remmingszones werden gemeten en de concentraties van wierookextract die duidelijke zones (remmingszone) rond de schijven vertoonden, werden geacht een remmend effect te hebben op de geteste bacteriën.

4.9. Bepaling van MIC-waarden De MIC-waarden van wierookextract tegen P. gingivalis-isolaten werden geschat met behulp van de bouillon-microdilutiemethode. In het kort werden kweken van P. gingivalis gedurende de nacht gekweekt in BHI-bouillon die hemine (5 µg/ml) en vitamine K1 (1 µg/ml) bevatte. Vervolgens werden 100 µl bacteriën plus 100 µl seriële verdunningen (tweevoudig) van het wierookextract (beginnend vanaf 2000 µg/ml) in BHI gemengd in de putjes van de microtiterplaat. Elke microtiterplaat had een putje voor de negatieve controle met BHI zonder bacteriën en een putje voor de positieve controle met alleen bacteriën zonder het extract. Na anaërobe incubatie bij 37°C gedurende 24 uur werd de bacteriegroei visueel geïnspecteerd. De MIC-waarden werden geregistreerd als de laagste concentraties die een remming van de bacteriegroei veroorzaakten. Alle volgende experimenten werden uitgevoerd voor en na behandeling van P. gingivalis-isolaten met subremmende concentraties (0,5 MIC) van het wierookextract.

4.10. Bacteriële groeicurve P. gingivalis-isolaten werden gekweekt in bloedagarplaten, aangevuld met 5% schapenbloed, hemine (5 μg/ml) en vitamine K1 (0,5 μg/ml), gedurende 5-7 dagen onder anaërobe omstandigheden bij 37°C. C [43]. Vervolgens werd een enkele kolonie van elk isolaat geïnoculeerd in BHI-bouillon, die hemine (5 µg/ml) en vitamine Kl (1 µg/ml) bevatte, en gedurende 24 uur anaëroob gekweekt. De waarden van de optische dichtheid (OD) bij 600 nm werden elke 2 uur gedetecteerd. met behulp van UV-VIS-spectrofotometer (Shimadzu, Japan), en de groeicurven werden geconstrueerd door de log OD uit te zetten tegen de bemonsteringstijd (uren).

4.11. Meting van nucleïnezuurlekkage De afgifte van nucleïnezuren uit de bacteriecellen werd gemeten zoals eerder beschreven. P. gingivalis-isolaten werden in de log-fase gecentrifugeerd en de pellets werden opnieuw gesuspendeerd in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd onder anaerobe omstandigheden. De afgifte van cellulaire nucleïnezuren werd gemeten op verschillende tijdstippen van 0, 1, 2 en 4 uur. door meting van de absorptie bij 260 nm met behulp van een 1800 UV-VIS spectrofotometer (Shimadzu, Japan).

4.12. Antibiofilmactiviteit van wierookextract

Het werd uitgevoerd zoals eerder beschreven. In het kort, 100 µl P. gingivalis-suspensies werd geïnoculeerd en gekweekt in een microtiterplaat met 96 putjes onder anaerobe omstandigheden bij 37°C. Na 72 uur incubatie werden de niet-hechtende cellen verwijderd door middel van wassen met PBS en liet men ze 1 uur drogen. De biofilms werden gekleurd met een oplossing van 0,1% kristalviolet en de monsters werden gewassen met gedestilleerd water. Voor kwantitatieve analyse van biofilmproductie werd 125 µl 30% azijnzuur toegevoegd en werd de OD bij 492 nm gemeten met behulp van ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Oostenrijk). Het percentage biofilmreductie werd berekend met de formule:

% vermindering van biofilmvorming=(OD onbehandeld-OD behandeld)/(OD onbehandeld) x 100 Meting van de extracellulaire polysacchariden De polysacchariden gevonden in de extracellulaire polymere substantie (EPS) van de gevormde biofilm werden geschat met behulp van de fenol-zwavelzuurmethode [ 43]. In het kort werden microtiterplaten, na 3 dagen biofilmvorming door P. gingivalis-isolaten, gewassen met PBS om de vrij zwevende bacteriën te verwijderen en aan de lucht gedroogd. Vervolgens werd 40 µl steriel water plus 40 µl 6% fenoloplossing, gevolgd door 200 µl 97% zwavelzuur aan elk putje toegevoegd. De platen werden vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur gelaten en het aantal polysacchariden in de gevormde biofilm werd bepaald door de absorptie te meten bij een OD van 490 nm met behulp van ELISA Auto Reader (Sunrise Tecan, Oostenrijk). We gebruikten verschillende glucoseconcentraties (0, 5, 10, 20 en 100 mg/L) als standaard om de OD-waarden om te rekenen naar polysaccharideconcentraties.

4.14. Hydrofobiciteit van het bacteriële celoppervlak

De bacteriële hydrofobiciteit werd beoordeeld met behulp van de koolwaterstof-xyleentest. In het kort, P. gingivalis-isolaten werden anaëroob gekweekt en de na centrifugatie verzamelde pellets werden opnieuw gesuspendeerd in fosfaatureummagnesiumsulfaatbuffer (PUM-buffer, pH 6,9). Vervolgens werden volumes van 0,3, 0,9, 1,2 en 1,8 ml n-hexaan toegevoegd aan 4,8 ml van de bacteriesuspensie. Men liet de mengsels 2 uur staan ​​en de waterige fase werd voorzichtig afgescheiden. De absorptie van de geteste isolaten die in de waterige fase achterbleven werd gemeten bij 540 nm. HI werd geïdentificeerd door de volgende vergelijking:

HI=(A540 controle-A540 test)/(A540 controle) 4.15. Onderzoek van biofilmmorfologie door lichtmicroscoop en SEM Het werd uitgevoerd volgens Qi et al. In het kort werden twee groepen glazen dekglaasjes overspoeld met P. gingivalis-isolaten (met en zonder wierookextract) en werden ze drie dagen onder anaerobe omstandigheden gelaten om de isolaten biofilms te laten vormen. De eerste groep van de gevormde biofilms door P. gingivalis- isolaten werd gevisualiseerd door een helderveldmicroscoop (Labomed, Amerika) met een vergroting van 100 x na kleuring met kristalviolet. De tweede groep van de gevormde biofilms werd gespoeld met behulp van PBS en ondergedompeld in 2,5% glutaaraldehyde-oplossing gedurende 24 uur bij 4°C. Vervolgens werden ze achtereenvolgens gedehydrateerd met behulp van een reeks ethanol; concentraties variërend van 30% tot 100%, laten drogen, en sputter-gecoat met goud voor onderzoek met SEM (Hitachi, Japan).

4.16. qRT-PCR Relatieve genexpressie van fimA-, hagA-, hagB-, rgpA- en kgp-genen werd onderzocht met behulp van qRT-PCR. De gebruikte primers staan ​​​​vermeld in tabel S1 en het 16S-rRNA-gen was het huishoudgen of de endogene controle. Alle experimenten werden drie keer uitgevoerd en de resultaatwaarden werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De amplificatie werd uitgevoerd door Power SYBR® Green master mix (Thermo SCIENTIFIC, VS) met behulp van het Rotor-Gene Q5 plex instrument (Qiagen, Duitsland). De relatieve genexpressie werd bepaald met behulp van de methode van 2-ΔΔCt met behulp van de onbehandelde isolaten als controlemonsters (de expressie was ingesteld op 1). Veranderingen in de genexpressie met ≥ 2-voudig (verhoogd of verlaagd) werden als statistisch significant beschouwd