胚選択試験のための非侵襲的染色体スクリーニング (NICEST)

仮説：

発生中の胚から使用済み培養液 (SCM) に放出された無細胞 DNA (cfDNA) の分析は、異数性 (PGT-A) の着床前遺伝子検査を実行するための非侵襲的な方法として役立ちます。 臨床転帰を移植胚のNI-PGT-A結果と盲検的に比較する非選択研究では、陽性および陰性の予測値を決定することによって診断精度を特徴付ける

理由:

体外受精 (IVF) プロセス中、健康な胚の選択は、顕微鏡の外観では染色体の補体を明らかにできないために制限されます。 したがって、染色体的に正常な胚を確実に選択するために、異数性の着床前遺伝子検査（PGT-A）が行われます。 PGT-A では、染色体のコピー数を決定するために、胚の生検、DNA の増幅、次世代シーケンシング (NGS) が必要です。

PGT-A の臨床的有用性は実証されていますが、プロセスには制限があり、その中で最も重要なのは胚生検の要件です。 通常、透明帯が破られた後、5 ～ 10 個の細胞が TE から除去されます。 この手順は、訓練を受けた発生学者によって安全かつ効果的に実行できますが、胚への損傷に対する明らかな懸念が関連しています。 着床が成功したとしても、この段階での胚の生検は、流産などの合併症や妊娠後期の胎盤機能の問題につながる可能性があるという懸念が提起されています. さらに、TE は胎児自体ではなく胎盤に分化する運命にあるため、これらの細胞の染色体分析が常に胎児の染色体補体を表すかどうかに関しては論争があります。 これらの理由と、TE 生検は骨の折れる費用がかかるため、PGT-A は胚選択の臨床基準として形態学的評価に取って代わるものではありません。

着床前の胚の異数性スクリーニングのための正確な非侵襲的方法が理想的です。 この目的のために、非侵襲的な PGT-A (NI-PGT-A) メソッドの開発は、活発な調査が行われている分野です。 このアプローチは、胚盤胞から使用済み培養培地 (SCM) に分泌される無細胞 DNA (cfDNA) を分​​離する機能を活用します。 SCM は通常、胚を培養から取り出した後に廃棄しますが、胚から微量の DNA を分離、増幅し、染色体コピー数解析のために配列決定することができます。 明らかな利点は、胚に害を及ぼすことなくこのプロセスを実行できることです。 この非侵襲的アプローチの追加の推定上の利点は、DNA が TE と内部細胞塊 (ICM) の両方から分泌され、理論的には TE 生検のみから分離された DNA よりも正確な胎児核型の表現として機能することです。

NI-PGT-A を導入する際の技術的な制限は、SCM で利用できる DNA の量が限られていることに関連しています。 十分な量の遺伝物質が血液、羊水、または組織生検から容易に抽出される遺伝子検査の他のモードとは異なり、胚盤胞からの無細胞 DNA 分泌は非常に微量です。 しかし、研究室のプロトコルは急速に発展しており、NI-PGT-A と従来の PGT-A を並行して染色体コピー数を分析すると、高いレベルの一貫性がすでに実証されている多数の出版物によって証明されています。

これらの研究は概念実証と前臨床検証を示していますが、真の診断精度は、陰性 (正倍数体) および陽性 (異数体) の結果の予測値を評価することによってのみ評価できます。 具体的には、正倍数体であることが判明した胚は、出生に至る持続的な着床の能力が高いはずですが、異数体の胚は、持続的な着床率が劇的に低くなるか、臨床的異数性を予測することになります。 厳密な臨床的検証がなければ、これらの結果を胚の選択に使用すると、誤診につながり、不健康な胚の選択、または潜在的に生存可能であった可能性のある胚に対する選択が発生する可能性があります.

NI-PGT-A が臨床的に堅牢であるかどうかを判断するために、非選択のパイロット研究を提案します。これにより、通常の臨床的方法 (すなわち、形態学的選択) によって胚の選択が実行されます。 ただし、臨床転帰が明らかになった後、SCM は盲目的に市販の NI-PGT-A プロトコルによって分析されます。 臨床転帰を NI-PGT-A の結果と相関させることにより、陽性および陰性の予測値を偏りなく計算できます。 臨床ルーチンから逸脱する介入は行われないため、胚や親に追加のリスクが生じることはありません。

この研究は、可能な将来の試験のパイロットとして機能します。 NI-PGT-A の妥当な予測値が示されれば、臨床環境における NI-PGT-A の有用性を調査するための前向き選択研究が正当化される可能性があります。

研究デザイン:

患者は、臨床適応症ごとに IVF-ICSI を受け、遅延胚移植のためにすべての胚を凍結する計画があります。 胚培養は通常のプロトコルに従い、移植のための胚の選択は標準的な形態学的基準を使用して行われます。 生存可能と思われるすべての胚盤胞からの SCM が収集され、参照ラボに送られます (シーケンス 46)。 検体は患者情報を完全に匿名化し、アクセッション番号をラベル付けします。 NI-PGT-A 分析は、製造業者の推奨に従って市販のキットを使用して実行され、技術者は臨床転帰を知らされません。 患者が胚移植サイクルのために戻ってきたら、子宮内膜の準備のためにルーチンの臨床プロトコルに従います。 通常の形態学的等級付け基準に従って単一の胚が選択され、標準的な技術で胚移植が行われます。 最初の妊娠結果は、血清hCG検査で記録されます。 hCG検査が陽性の場合、臨床ルーチンごとに超音波検査で早期妊娠が確認されます。 すべての患者が治療を完了し、臨床転帰が明らかになった後 (着床の失敗、流産、または継続的な妊娠 (13 週間を超える生存率として定義))、NI-PGT-A の結果が臨床チームに公開され、臨床転帰と相関して予測値。 進行中のすべての妊娠には、胎児の異数性に関する定期的な出生前スクリーニングが提供されます。

実験プロトコルに関する追加の詳細は次のとおりです。

胚盤胞培養 胚培養は通常のプロトコルに従います。 受精後 3 日目に、胚は、母体細胞汚染の可能性を下げるために、一連の培養液の液滴を通して繰り返しピペッティングされます。 胚は、胚盤胞段階まで胚培養培地の35μLの液滴で個別に培養されます。 5日目または6日目に、標準的な形態学的基準を使用して胚盤胞の発生と品質を評価します。

サンプル収集と胚盤胞のガラス化 選択された胚からの胚盤胞培養培地 (20µL) を収集して PCR チューブに移し、全ゲノム増幅 (WGA) まで -20°C で保存します。 胚盤胞は、ルーチンのガラス化プロトコルによって凍結され、ルーチンの臨床プロトコルに従って液体窒素で保存されます。 標本は、参照ラボに出荷する前に、患者情報を完全に匿名化し、受入番号でラベル付けされます (Sequence46)。

全ゲノム増幅および DNA シーケンシング NI-PGT-A 分析は、受領次第、メーカーの推奨に従って市販のキットを使用して実行され、技術者は臨床転帰を知らされません。 DNA は、全ゲノム増幅 (WGA) によって増幅され、ライブラリを準備するためにバーコード化されます。 ライブラリーは、自動クローン増幅によるテンプレート調製のために Ion Chef 装置にロードされ、サンプルあたり約 150,000 ～ 200,000 のシーケンス読み取りで、Ion Genestudio S5 Prime システムでの DNA シーケンスのためにチップにロードされます。 Ion Reporter ソフトウェア (v5.10 以降) を使用してデータを分析します。 倍数性は、ベースライン、Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline を使用して測定されます。 標準的な品質管理手段が評価されます。 結果は、胚移植の6週間後に臨床チームに公開され、予測値の計算のために臨床転帰と関連付けられます。

患者集団:

包含基準:

IVF-ICSI を受けている患者 登録時の年齢が 21 ～ 35 歳 選択的凍結全サイクル 単一胚移植の計画

除外基準:

PGT-A、PGT-SR、PGT-M を受けている 流産を繰り返した経験 着床失敗を繰り返した経験 複数の胚移植を計画している

年齢カテゴリの正当化は、着床に影響を与える可能性のある異数性以外の年齢関連要因を制御することであり、予測値の計算を複雑にする可能性のある変数が最小限に抑えられます。 参加者を 35 歳未満の患者に制限することで、形態学的に正常な胚が健康である可能性が最も高くなるように、胚の選択も最適化されます。 さらに、この年齢カテゴリーの患者は、ダウン症候群などの臨床的異数性のリスクが最も低いです。

データの管理と保管:

研究サンプルは、固有の受入番号によって識別されますが、患者を識別する情報はありません。 サンプルは Sequence46 によって処理され、結果はアクセッション番号に関連付けられます。 データは安全なクラウド サービスを介してアップロードされます。このクラウド サービスは、バックアップされる暗号化されたハード ドライブ上のオリーブ不妊治療センターでローカルに保存される電子症例報告フォーム (eCRF) と結合するために、主要な研究者によってアクセスされます。セカンダリ ローカル ドライブにアップします。 eCRF には、患者固有の医療記録番号と年齢が含まれますが、名前、生年月日、またはその他の識別情報は記録されません。 NI-PGT-A 分析の結果と臨床転帰も eCRF に保存されます。

研究データは、公開日から 5 年間保持されます。

統計分析：

診断精度は、正と負の予測値のコンテキストで解釈されます。

肯定的な結果は、異数性またはモザイク現象と一致する所見です。 否定的な結果は、正倍数性と一致する所見です。

PPV = (着床の失敗 + 流産 + 臨床的異数性)/すべての肯定的な結果 NPV = 進行中の妊娠/すべての否定的な結果

サンプルサイズの計算:

このパイロット研究には 120 人の患者で十分です。 以前の研究では、35 歳以下の患者では、正倍数体:異数体胚の比率が約 60:40 であることが確立されています。 正倍数体の胚のうち、約 70% が着床し、そのうち 85% が生存可能になります。 異数性胚のうち、約 25% が着床し、そのうち >99% が流産します。臨床的異数性のリスクは、35 歳以下の女性で 0.5% 未満です。

これらの確率を考えると、登録される 120 人の患者のうち、72 個の正倍数体胚が期待され、そのうち 50 個が着床し、43 個が進行中の実行可能な妊娠として継続されます。 異数性であると予想される48個のうち、12個が着床し、そのすべてが流産するはずです（この集団における臨床的異数性の可能性は0.5％未満です）。

募集：

Olive Fertility Center で IVF-ICSI を追求し、包含/除外基準を満たす患者は、共同研究者によって直接募集されます。 チラシはクリニック内に掲示します。