Niet-invasieve chromosomale screening voor embryoselectieproef (NICEST)

Hypothese:

Analyse van celvrij DNA (cfDNA) dat vrijkomt uit zich ontwikkelende embryo's in verbruikte kweekmedia (SCM) kan dienen als een niet-invasieve methode voor het uitvoeren van pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie (PGT-A). Een niet-selectieonderzoek dat klinische uitkomsten vergelijkt met de NI-PGT-A-resultaten van de teruggeplaatste embryo's op een geblindeerde manier zal de diagnostische nauwkeurigheid karakteriseren door bepaling van positieve en negatieve voorspellende waarden

Rechtvaardiging:

Tijdens het in-vitrofertilisatieproces (IVF) wordt de selectie van een gezond embryo beperkt door het onvermogen van het microscopische uiterlijk om het chromosomale complement te onthullen. Om op betrouwbare wijze chromosomaal normale embryo's te selecteren, wordt pre-implantatie genetisch testen op aneuploïdie (PGT-A) uitgevoerd. PGT-A vereist biopsie van het embryo, amplificatie van het DNA en vervolgens next generation sequencing (NGS) om het aantal chromosoomkopieën te bepalen.

Hoewel het klinische nut van PGT-A is aangetoond, heeft het proces beperkingen, waarvan de belangrijkste de vereiste is voor embryobiopsie. Meestal worden 5-10 cellen uit de TE verwijderd nadat de zona pellucida is doorbroken. Hoewel de procedure veilig en effectief kan worden uitgevoerd door getrainde embryologen, is de duidelijke zorg voor schade aan het embryo relevant. Zelfs als implantatie met succes plaatsvindt, is er bezorgdheid geuit dat biopsie van het embryo in dit stadium kan leiden tot complicaties zoals een miskraam of problemen met de placentafunctie later in de zwangerschap. Bovendien, omdat de TE voorbestemd is om te differentiëren naar placenta in plaats van naar de foetus zelf, is er controverse over de vraag of de chromosomale analyse van deze cellen altijd representatief is voor het chromosomale complement van de foetus. Om deze redenen, en omdat TE-biopsie arbeidsintensief en duur is, heeft PGT-A de morfologische evaluatie nog steeds niet verdrongen als de klinische standaard voor embryoselectie.

Een nauwkeurige niet-invasieve methode voor aneuploïdiescreening van embryo's vóór implantatie zou ideaal zijn. Daartoe is de ontwikkeling van niet-invasieve PGT-A (NI-PGT-A) methoden een gebied van actief onderzoek. De aanpak maakt gebruik van het vermogen om celvrij DNA (cfDNA) te isoleren dat wordt uitgescheiden door de blastocyst in de verbruikte kweekmedia (SCM). SCM wordt routinematig weggegooid nadat het embryo uit de kweek is gehaald, maar minieme hoeveelheden DNA van het embryo kunnen worden geïsoleerd, geamplificeerd en vervolgens worden gesequenced voor analyse van het aantal chromosomale kopieën. Het voor de hand liggende voordeel is dat dit proces kan plaatsvinden zonder het embryo schade toe te brengen. Een bijkomend vermeend voordeel van deze niet-invasieve benadering is dat het DNA wordt uitgescheiden door zowel de TE als de binnenste celmassa (ICM), wat in theorie dient als een nauwkeuriger weergave van het foetale karyotype dan het DNA dat alleen uit de TE-biopsie is geïsoleerd.

Technische beperkingen van het inzetten van NI-PGT-A houden verband met de beperkte hoeveelheid DNA die beschikbaar is in de SCM. In tegenstelling tot andere manieren van genetisch testen waarbij grote hoeveelheden genetisch materiaal gemakkelijk uit bloed, vruchtwater of weefselbiopten worden gehaald, is de celvrije DNA-uitscheiding van blastocysten uitzonderlijk klein. Laboratoriumprotocollen ontwikkelen zich echter snel, wat blijkt uit talloze publicaties die al een hoge mate van consistentie hebben aangetoond wanneer het aantal chromosomale kopieën parallel wordt geanalyseerd door NI-PGT-A en traditionele PGT-A.

Hoewel deze onderzoeken proof of concept en preklinische validatie hebben geïllustreerd, kan de werkelijke diagnostische nauwkeurigheid alleen worden beoordeeld door de voorspellende waarde van negatieve (euploïde) en positieve (aneuploïde) resultaten te evalueren. In het bijzonder zouden embryo's waarvan is vastgesteld dat ze euploïd zijn, een groter vermogen moeten hebben voor aanhoudende implantatie die overgaat tot levend geboren worden, terwijl aneuploïde embryo's een dramatisch lagere mate van aanhoudende implantatie zouden moeten hebben, of voorspellend zullen zijn voor klinische aneuploïdie. Zonder rigoureuze klinische validatie zou het gebruik van deze resultaten voor embryoselectie kunnen leiden tot een verkeerde diagnose, selectie van ongezonde embryo's of selectie tegen embryo's die potentieel levensvatbaar zouden kunnen zijn.

Om te bepalen of NI-PGT-A klinisch robuust is, stellen we een pilotstudie zonder selectie voor, waarbij embryoselectie wordt uitgevoerd door middel van routinematige klinische methoden (dwz morfologische selectie). Nadat de klinische uitkomst zich heeft gemanifesteerd, zal de SCM echter op een geblindeerde manier worden geanalyseerd door een in de handel verkrijgbare NI-PGT-A-protocollen. Door klinische uitkomsten te correleren met NI-PGT-A-resultaten, kunnen positieve en negatieve voorspellende waarden zonder vooroordelen worden berekend. Omdat er geen ingreep wordt uitgevoerd die afwijkt van de klinische routine, is er geen extra risico voor het embryo of de ouder.

Deze studie zal dienen als pilot voor mogelijke toekomstige proeven. Als een redelijke voorspellende waarde van NI-PGT-A wordt aangetoond, kan een prospectieve selectiestudie gerechtvaardigd zijn om het nut van NI-PGT-A in een klinische setting te onderzoeken.

Onderzoeksopzet:

Patiënten ondergaan IVF-ICSI per klinische indicatie, met plannen om alle embryo's in te vriezen voor uitgestelde embryotransfer. Embryocultuur zal routinematige protocollen volgen en embryoselectie voor terugplaatsing zal worden uitgevoerd met behulp van standaard morfologische criteria. SCM van alle blastocysten die levensvatbaar lijken, zal worden verzameld en verzonden naar een referentielaboratorium (Sequence 46). Specimens zullen volledig worden geanonimiseerd van patiëntinformatie en worden gelabeld met een toegangsnummer. NI-PGT-A-analyse zal worden uitgevoerd met behulp van een commerciële kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant, met technici die blind zijn voor klinische resultaten. Wanneer patiënten terugkeren voor de embryotransfercyclus, zal het routinematige klinische protocol worden gevolgd voor de voorbereiding van het endometrium. Een enkel embryo zal worden geselecteerd volgens routinematige morfologische classificatiecriteria en de embryotransfer zal worden uitgevoerd met standaardtechnieken. Het aanvankelijke resultaat van de zwangerschap zal worden gedocumenteerd met serum-hCG-testen. Als de hCG-test positief is, wordt de vroege zwangerschap bevestigd met echografie volgens klinische routine. Nadat alle patiënten de behandeling hebben voltooid en de klinische uitkomsten zich manifesteren (mislukte implantatie, miskraam of doorgaande zwangerschap (gedefinieerd als levensvatbaarheid langer dan 13 weken), worden de NI-PGT-A-resultaten vrijgegeven aan het klinische team en gecorreleerd met klinische uitkomsten voor de berekening van voorspellende resultaten. waarden. Alle doorgaande zwangerschappen krijgen routine prenatale screening aangeboden voor foetale aneuploïdie.

Aanvullende details met betrekking tot laboratoriumprotocollen zijn als volgt:

Blastocystcultuur Embryocultuur zal routineprotocollen volgen. Op dag 3 na de bevruchting worden de embryo's herhaaldelijk door een reeks druppeltjes kweekmedia gepipetteerd om de kans op maternale celbesmetting te verkleinen. Embryo's zullen vervolgens individueel worden gekweekt in 35 µl druppeltjes embryokweekmedium tot het blastocyststadium. Op dag 5 of dag 6 worden de ontwikkeling en kwaliteit van de blastocyst beoordeeld aan de hand van standaard morfologische criteria.

Monstername en blastocystvitrificatie Blastocyst-kweekmedium (20 µL) van geselecteerde embryo's wordt verzameld en overgebracht naar PCR-buisjes en bewaard bij -20°C tot volledige genoomamplificatie (WGA). Blastocysten worden ingevroren via een routinematig vitrificatieprotocol en opgeslagen in vloeibare stikstof volgens een routinematig klinisch protocol. Specimens worden volledig geanonimiseerd van patiëntgegevens en gelabeld met een toegangsnummer voordat ze naar het referentielaboratorium worden verzonden (Sequence46).

Volledige genoomamplificatie en DNA-sequencing NI-PGT-A-analyse zal na ontvangst worden uitgevoerd met behulp van een commerciële kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant, met technici die blind zijn voor klinische resultaten. DNA zal worden geamplificeerd door middel van volledige genoomamplificatie (WGA) en zal worden voorzien van een streepjescode om bibliotheken voor te bereiden. De bibliotheken worden vervolgens op een Ion Chef-instrument geladen voor sjabloonvoorbereiding door geautomatiseerde klonale amplificatie en vervolgens op een chip geladen voor DNA-sequencing op een Ion Genestudio S5 Prime-systeem, met ongeveer 150.000-200.000 sequencing-uitlezingen per monster. Gegevens worden geanalyseerd met behulp van de Ion Reporter-software (v5.10 of hoger). Ploïdie zal worden gemeten met behulp van baseline, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline. Standaard kwaliteitscontrolemaatregelen zullen worden geëvalueerd. De resultaten zullen 6 weken na de embryotransfer worden vrijgegeven aan het klinische team en worden gecorreleerd met klinische resultaten voor de berekening van voorspellende waarden.

Patiëntenpopulatie:

Inclusiecriteria:

Patiënt die IVF-ICSI ondergaat 21 - 35 jaar oud op het moment van inschrijving Electieve cyclus 'alles bevriezen' Planning voor terugplaatsing van één embryo

Uitsluitingscriteria:

PGT-A, PGT-SR, PGT-M ondergaan Voorgeschiedenis van herhaaldelijk zwangerschapsverlies Voorgeschiedenis van herhaaldelijk implantatiefalen Plannen voor terugplaatsing van meer dan 1 embryo

De rechtvaardiging voor de leeftijdscategorie is om te controleren voor andere leeftijdsgerelateerde factoren dan aneuploïdie die de implantatie kunnen beïnvloeden, zodat variabelen die voorspellende waardeberekeningen zouden kunnen samenstellen, worden geminimaliseerd. Deelname beperken tot patiënten onder de 35 jaar optimaliseert ook de embryoselectie zodat morfologisch normale embryo's hoogstwaarschijnlijk gezond zijn. Bovendien hebben patiënten in deze leeftijdscategorie het laagste risico op klinische aneuploïdieën zoals het syndroom van Down.

Gegevensbeheer en -opslag:

Onderzoeksmonsters worden geïdentificeerd aan de hand van een uniek toegangsnummer, maar geen patiëntidentificerende informatie. De monsters worden verwerkt door Sequence46 met resultaten die zijn gekoppeld aan het toegangsnummer. De gegevens worden geüpload via een beveiligde cloudservice, waartoe de hoofdonderzoeker toegang heeft om deze samen te voegen met het elektronische casusrapportformulier (eCRF) dat lokaal in het Olive Fertility Center wordt opgeslagen op een gecodeerde harde schijf die wordt ondersteund- op een secundaire lokale schijf. De eCRF bevat het unieke medische dossiernummer en de leeftijd van de patiënt, maar vermeldt geen naam, geboortedatum of andere identificerende informatie. De resultaten van de NI-PGT-A-analyse en de klinische uitkomst worden ook opgeslagen in de eCRF.

Onderzoeksgegevens worden tot 5 jaar na publicatiedatum bewaard.

Statistische analyse:

Diagnostische nauwkeurigheid zal worden geïnterpreteerd in de context van positieve en negatieve voorspellende waarden.

Een positief resultaat is een bevinding die consistent is met aneuploïdie of mozaïcisme. Een negatief resultaat is een bevinding die consistent is met euploïdie.

PPV = (Mislukte implantatie + miskraam + klinische aneuploïdie)/ Alle positieve resultaten NPV = Doorgaande zwangerschap / Alle negatieve resultaten

Berekening van de steekproefomvang:

Honderdtwintig (120) patiënten zouden voldoende moeten zijn voor deze pilootstudie. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat bij patiënten van 35 jaar of jonger de verhouding euploïde:aneuploïde embryo's ongeveer 60:40 is. Van de euploïde embryo's zal ongeveer 70% implanteren, waarvan 85% levensvatbaar moet blijven. Van de aneuploïde embryo's zal ongeveer 25% implanteren, waarvan> 99% een miskraam zal krijgen; het risico op een klinische aneuploïdie is minder dan 0,5% bij vrouwen van 35 jaar en jonger.

Gezien deze waarschijnlijkheid worden van de 120 patiënten die zullen worden ingeschreven, 72 euploïde embryo's verwacht, waarvan er 50 zullen worden geïmplanteerd en 43 zullen doorgaan als doorgaande, levensvatbare zwangerschappen. Van de 48 die naar verwachting aneuploïde zullen zijn, zullen er 12 worden geïmplanteerd, waarvan ze allemaal een miskraam zouden moeten krijgen (de kans op een klinische aneuploïdie in deze populatie is minder dan 0,5%).

Werving:

Patiënten die IVF-ICSI volgen in het Olive Fertility Center en voldoen aan de inclusie-/uitsluitingscriteria, zullen rechtstreeks door de mede-onderzoekers worden geworven. In de kliniek worden flyers opgehangen.