배아 선택 시험을 위한 비침습적 염색체 스크리닝 (NICEST)

가설:

발달 중인 배아에서 사용된 배양 배지(SCM)로 방출된 무세포 DNA(cfDNA) 분석은 이수성(PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를 수행하기 위한 비침습적 방법의 역할을 할 수 있습니다. 맹검 방식으로 이식된 배아의 NI-PGT-A 결과와 임상 결과를 비교하는 비선택 연구는 양성 및 음성 예측값을 결정하여 진단 정확도를 특성화합니다.

정당화:

체외 수정(IVF) 과정에서 건강한 배아의 선택은 염색체 보체를 드러내는 현미경적 외관의 무능력으로 인해 제한됩니다. 따라서 염색체가 정상인 배아를 안정적으로 선별하기 위해 착상 전 이배수체 유전자 검사(PGT-A)를 시행합니다. PGT-A는 염색체 사본 수를 결정하기 위해 배아 생검, DNA 증폭, 차세대 시퀀싱(NGS)이 필요합니다.

PGT-A의 임상적 유용성이 입증되었지만 프로세스에는 한계가 있으며 그 중 가장 중요한 것은 배아 생검에 대한 요구 사항입니다. 일반적으로 투명대(zona pellucida)가 위반된 후 TE에서 5-10개의 세포가 제거됩니다. 이 절차는 훈련된 배아학자가 안전하고 효과적으로 수행할 수 있지만 배아 손상에 대한 명백한 우려는 관련이 있습니다. 착상에 성공하더라도 이 단계에서 배아 생검을 하면 유산 등의 합병증이나 임신 후기 태반 기능 문제가 생길 수 있다는 우려가 제기됐다. 또한 TE는 태아 자체가 아닌 태반으로 분화하도록 되어 있기 때문에 이러한 세포의 염색체 분석이 항상 태아의 염색체 보체를 나타내는지에 대한 논란이 있습니다. 이러한 이유로 그리고 TE 생검은 힘들고 비용이 많이 들기 때문에 PGT-A는 여전히 배아 선택을 위한 임상 표준으로서 형태학적 평가를 대체하지 못했습니다.

이식 전 배아의 이수성 스크리닝을 위한 정확한 비침습적 방법이 이상적일 것입니다. 이를 위해 비침습적 PGT-A(NI-PGT-A) 방법의 개발이 활발히 진행되고 있는 분야입니다. 이 접근 방식은 배반포에서 사용된 배양 배지(SCM)로 분비되는 무세포 DNA(cfDNA)를 분리하는 기능을 활용합니다. SCM은 배양에서 배아를 제거한 후 일상적으로 폐기되지만 배아에서 소량의 DNA를 분리, 증폭한 다음 염색체 복제 수 분석을 위해 시퀀싱할 수 있습니다. 명백한 이점은 이 과정이 배아에 해를 끼치지 않고 발생할 수 있다는 것입니다. 이 비침습적 접근법의 추가 추정 이점은 DNA가 TE와 내부 세포 덩어리(ICM) 모두에서 분비되어 이론적으로 TE 생검 단독에서 분리된 DNA보다 태아 핵형을 더 정확하게 나타내는 역할을 한다는 것입니다.

NI-PGT-A 배포의 기술적 한계는 SCM에서 사용할 수 있는 DNA의 제한된 수량과 관련이 있습니다. 충분한 양의 유전 물질이 혈액, 양수 또는 조직 생검에서 쉽게 추출되는 다른 유전자 검사 모드와 달리 배반포에서 무세포 DNA 분비는 매우 적습니다. 그러나 실험실 프로토콜은 빠르게 발전하고 있으며, NI-PGT-A와 기존 PGT-A를 동시에 사용하여 염색체 사본 수를 분석할 때 높은 수준의 일관성을 이미 입증한 수많은 간행물에서 입증되었습니다.

이러한 연구가 개념 증명 및 전임상 검증을 설명했지만, 진정한 진단 정확도는 음성(정배수체) 및 양성(이배수체) 결과의 예측 값을 평가해야만 평가할 수 있습니다. 구체적으로, 정배수체인 것으로 밝혀진 배아는 정상 출산으로 진행되는 지속적인 착상 능력이 더 큰 반면, 이배수체 배아는 지속 착상 비율이 극적으로 낮아야 하거나 임상적 이수성을 예측할 수 있어야 합니다. 엄격한 임상 검증 없이 배아 선택에 이러한 결과를 사용하면 오진으로 이어져 건강하지 않은 배아를 선택하거나 잠재적으로 생존할 수 있었던 배아를 선택하게 될 수 있습니다.

NI-PGT-A가 임상적으로 견고한지 확인하기 위해 우리는 배아 선택이 일상적인 임상 방법(즉, 형태학적 선택)으로 수행되는 비선택, 파일럿, 연구를 제안합니다. 그러나 임상 결과가 나타난 후 SCM은 블라인드 방식으로 시판되는 NI-PGT-A 프로토콜로 분석됩니다. 임상 결과를 NI-PGT-A 결과와 연관시켜 편향 없이 양성 및 음성 예측 값을 계산할 수 있습니다. 임상적 일상에서 벗어나는 개입이 수행되지 않기 때문에 배아나 부모에게 추가 위험이 가해지지 않습니다.

이 연구는 가능한 향후 시험을 위한 파일럿 역할을 할 것입니다. NI-PGT-A의 합리적인 예측 가치가 입증되면 임상 환경에서 NI-PGT-A의 유용성을 조사하기 위해 전향적 선택 연구를 정당화할 수 있습니다.

연구 계획:

환자는 지연된 배아 이식을 위해 모든 배아를 동결할 계획과 함께 임상 적응증에 따라 IVF-ICSI를 받게 됩니다. 배아 배양은 일상적인 프로토콜을 따르고 이식을 위한 배아 선택은 표준 형태학적 기준을 사용하여 수행됩니다. 생존 가능한 것으로 보이는 모든 배반포의 SCM을 수집하여 참조 실험실로 배송합니다(시퀀스 46). 검체는 환자 정보를 완전히 비식별화하고 수탁 번호로 라벨을 붙입니다. NI-PGT-A 분석은 제조업체의 권장 사항에 따라 상용 키트를 사용하여 수행되며 기술자는 임상 결과를 볼 수 없습니다. 환자가 배아 이식 주기에 복귀하면 자궁내막 준비를 위해 일상적인 임상 프로토콜을 따를 것입니다. 단일 배아는 일상적인 형태학적 등급 기준에 따라 선택되고 배아 이식은 표준 기술로 수행됩니다. 초기 임신 결과는 혈청 hCG 검사로 문서화됩니다. hCG 검사가 양성인 경우, 임상 절차에 따라 초음파 평가로 조기 임신을 확인합니다. 모든 환자가 치료를 완료하고 임상 결과가 나타난 후(착상 실패, 유산 또는 임신 진행 중(13주 이상의 생존 가능성으로 정의됨), NI-PGT-A 결과가 임상 팀에 공개되고 예측 가능한 수치 계산을 위한 임상 결과와 상호 연관됩니다. 가치. 진행 중인 모든 임신에는 태아 이수성에 대한 정기적인 산전 선별 검사가 제공됩니다.

실험실 프로토콜에 대한 추가 세부 정보는 다음과 같습니다.

배반포 배양 배아 배양은 일상적인 프로토콜을 따릅니다. 수정 후 3일째에 배아는 모체 세포 오염 가능성을 낮추기 위해 일련의 배양 배지 방울을 통해 반복적으로 피펫팅됩니다. 그런 다음 배아는 배반포 단계까지 배아 배양 배지의 35µL 방울에서 개별적으로 배양됩니다. 5일 또는 6일에 배반포 발달 및 품질이 표준 형태학적 기준을 사용하여 평가됩니다.

샘플 수집 및 배반포 유리화 선택한 배아에서 배반포 배양 배지(20µL)를 수집하여 PCR 튜브로 옮기고 전체 게놈 증폭(WGA)까지 -20°C에서 보관합니다. 배반포는 일상적인 유리화 프로토콜을 통해 동결되고 일상적인 임상 프로토콜에 따라 액체 질소에 저장됩니다. 표본은 환자 정보를 완전히 비식별화하고 참조 실험실로 배송하기 전에 수탁 번호로 레이블을 지정합니다(Sequence46).

전체 게놈 증폭 및 DNA 시퀀싱 NI-PGT-A 분석은 제조업체의 권장 사항에 따라 상업용 키트를 사용하여 수령 즉시 수행되며 기술자는 임상 결과를 알 수 없습니다. DNA는 전체 게놈 증폭(WGA)에 의해 증폭되고 라이브러리를 준비하기 위해 바코드 처리됩니다. 그런 다음 자동 클론 증폭에 의한 템플릿 준비를 위해 라이브러리를 Ion Chef 기기에 로드한 다음 샘플당 약 150,000-200,000개의 시퀀싱 읽기와 함께 Ion Genestudio S5 Prime 시스템의 DNA 시퀀싱을 위해 칩에 로드합니다. 데이터는 Ion Reporter 소프트웨어(v5.10 이상)를 사용하여 분석됩니다. 배수성은 기준선인 Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome(99M) 기준선을 사용하여 측정됩니다. 표준 품질 관리 조치가 평가됩니다. 결과는 배아 이식 6주 후 임상 팀에 공개되며 예측 값 계산을 위한 임상 결과와 연관됩니다.

환자 인구:

포함 기준:

등록 당시 21 - 35세인 IVF-ICSI를 받는 환자 선택적 동결 주기 단일 배아 이식 계획

제외 기준:

PGT-A, PGT-SR, PGT-M을 겪고 있는 경우 반복적인 유산의 병력이 있는 경우 반복적인 착상 실패의 병력이 있는 경우 1개 이상의 배아 이식 계획이 있는 경우

연령 범주에 대한 정당성은 착상에 영향을 줄 수 있는 이배수성 이외의 연령 관련 요인을 통제하여 예측 값 계산을 복잡하게 만들 수 있는 변수를 최소화하는 것입니다. 35세 미만의 환자로 참여를 제한하면 형태학적으로 정상적인 배아가 건강할 가능성이 가장 높도록 배아 선택을 최적화할 수 있습니다. 또한, 이 연령 범주의 환자는 다운 증후군과 같은 임상적 이수성에 대한 위험이 가장 낮습니다.

데이터 관리 및 저장:

연구 샘플은 고유한 수탁 번호로 식별되지만 환자 식별 정보는 없습니다. 샘플은 수탁 번호와 관련된 결과와 함께 Sequence46에 의해 처리됩니다. 데이터는 안전한 클라우드 서비스를 통해 업로드되며, 전자 증례 보고서 양식(eCRF)과 통합하기 위해 주 조사관이 액세스하여 Olive Fertility Center에 백업될 암호화된 하드 드라이브에 로컬로 저장됩니다. 보조 로컬 드라이브에 있습니다. eCRF에는 환자의 고유한 의료 기록 번호와 나이가 포함되지만 이름, 생년월일 또는 기타 식별 정보는 기록되지 않습니다. NI-PGT-A 분석 결과 및 임상 결과도 eCRF에 저장됩니다.

연구자료는 게재일로부터 5년간 보관합니다.

통계 분석:

진단 정확도는 양성 및 음성 예측 값의 맥락에서 해석됩니다.

양성 결과는 이수성 또는 모자이즘과 일치하는 결과입니다. 음성 결과는 배수성과 일치하는 결과입니다.

PPV = (착상 실패 + 유산 + 임상적 이수성)/ 모든 양성 결과 NPV = 임신 진행 중 / 모든 음성 결과

샘플 크기 계산:

이 파일럿 연구에는 120명의 환자가 충분해야 합니다. 이전 연구에서는 35세 이하의 환자에서 정배수체:이배수체 배아의 비율이 약 60:40인 것으로 나타났습니다. 정배수체 배아 중 약 70%가 착상할 것이며, 그 중 85%는 계속 생존해야 합니다. 이배수체 배아 중 약 25%가 착상하고 그 중 >99%가 유산합니다. 임상적 이수성의 위험은 35세 이하 여성에서 0.5% 미만입니다.

이러한 확률을 고려할 때, 등록할 120명의 환자 중 72개의 정배수체 배아가 예상되며, 이 중 50개는 착상해야 하고 43개는 진행 중인 생존 가능한 임신으로 계속될 것입니다. 이배수체가 될 것으로 예상되는 48개 중 12개는 착상할 것이며, 그 중 모두가 유산해야 합니다(이 모집단에서 임상적 이배수체 가능성은 0.5% 미만입니다).

신병 모집:

Olive Fertility Center에서 IVF-ICSI를 추구하고 포함/제외 기준을 충족하는 환자는 공동 조사자가 직접 모집합니다. 전단지는 클리닉 내에 게시됩니다.