Neinvazivní chromozomální screening pro zkoušku selekce embryí (NICEST)

Hypotéza:

Analýza bezbuněčné DNA (cfDNA) uvolněné z vyvíjejících se embryí do použitého kultivačního média (SCM) může sloužit jako neinvazivní metoda pro provádění preimplantačního genetického testování aneuploidie (PGT-A). Nevýběrová studie, která porovnává klinické výsledky s výsledky NI-PGT-A transferovaných embryí zaslepeným způsobem, bude charakterizovat diagnostickou přesnost stanovením pozitivních a negativních prediktivních hodnot

Odůvodnění:

Během procesu in vitro fertilizace (IVF) je výběr zdravého embrya omezen neschopností mikroskopického vzhledu odhalit chromozomální komplement. Pro spolehlivou selekci chromozomálně normálních embryí se tedy provádí preimplantační genetické vyšetření na aneuploidii (PGT-A). PGT-A vyžaduje biopsii embrya, amplifikaci DNA a poté sekvenování nové generace (NGS) k určení počtu kopií chromozomů.

Zatímco klinická užitečnost PGT-A byla prokázána, proces má omezení, z nichž nejvýznamnější je požadavek na biopsii embrya. Typicky je 5-10 buněk odstraněno z TE poté, co byla porušena zona pellucida. I když tento postup mohou bezpečně a efektivně provádět vyškolení embryologové, zřejmá obava z poškození embrya je relevantní. I když k implantaci dojde úspěšně, byly vzneseny obavy, že biopsie embrya v této fázi může vést ke komplikacím, jako je potrat nebo problémy s placentární funkcí později v těhotenství. Kromě toho, protože TE je předurčen k diferenciaci na placentu spíše než na samotný plod, existuje spor o to, zda chromozomální analýza těchto buněk vždy reprezentuje chromozomální komplement plodu. Z těchto důvodů a protože biopsie TE je pracná a nákladná, PGT-A stále nenahradila morfologické hodnocení jako klinický standard pro selekci embryí.

Ideální by byla přesná neinvazivní metoda screeningu aneuploidie embryí před implantací. Za tímto účelem je vývoj neinvazivních metod PGT-A (NI-PGT-A) oblastí aktivního zkoumání. Tento přístup využívá schopnost izolovat bezbuněčnou DNA (cfDNA), která se vylučuje z blastocysty do použitého kultivačního média (SCM). SCM je rutinně vyřazeno po vyjmutí embrya z kultury, avšak nepatrná množství DNA z embrya lze izolovat, amplifikovat a poté sekvenovat pro analýzu počtu chromozomálních kopií. Zjevnou výhodou je, že tento proces může nastat, aniž by došlo k poškození embrya. Další domnělou výhodou tohoto neinvazivního přístupu je to, že DNA je secernována jak z TE, tak z vnitřní buněčné hmoty (ICM), což teoreticky slouží jako přesnější reprezentace fetálního karyotypu než DNA izolovaná pouze ze samotné biopsie TE.

Technická omezení nasazení NI-PGT-A souvisí s omezeným množstvím DNA dostupné v SCM. Na rozdíl od jiných způsobů genetického testování, kde je z krve, plodové vody nebo biopsie tkáně snadno extrahováno velké množství genetického materiálu, je sekrece bezbuněčné DNA z blastocyst výjimečně nepatrná. Laboratorní protokoly se však rychle vyvíjejí, o čemž svědčí četné publikace, které již prokázaly vysokou úroveň konzistence, když je počet chromozomálních kopií analyzován paralelně pomocí NI-PGT-A a tradičního PGT-A.

I když tyto studie ukázaly důkaz konceptu a preklinickou validaci, skutečnou diagnostickou přesnost lze posoudit pouze vyhodnocením prediktivní hodnoty negativních (euploidních) a pozitivních (aneuploidních) výsledků. Konkrétně embrya, u kterých bylo zjištěno, že jsou euploidní, by měla mít větší schopnost trvalé implantace, která pokračuje až k živému porodu, zatímco aneuploidní embrya by měla mít dramaticky nižší míru trvalé implantace nebo by předpovídala klinickou aneuploidii. Bez přísné klinické validace by použití těchto výsledků pro selekci embryí mohlo vést k nesprávné diagnóze, což by způsobilo selekci nezdravých embryí nebo selekci proti embryím, která by mohla být potenciálně životaschopná.

Abychom určili, zda je NI-PGT-A klinicky robustní, navrhujeme bezvýběrovou pilotní studii, kdy se selekce embryí provádí rutinními klinickými metodami (tj. morfologickým výběrem). Po manifestaci klinického výsledku však bude SCM analyzována komerčně dostupnými protokoly NI-PGT-A zaslepeným způsobem. Korelací klinických výsledků s výsledky NI-PGT-A lze vypočítat pozitivní a negativní prediktivní hodnoty bez zkreslení. Protože nebude proveden žádný zásah, který by se odchyloval od klinické rutiny, nebude představovat žádné další riziko pro embryo ani rodiče.

Tato studie bude sloužit jako pilotní případ pro možné budoucí pokusy. Pokud se prokáže rozumná prediktivní hodnota NI-PGT-A, může být oprávněná prospektivní selekční studie prozkoumat užitečnost NI-PGT-A v klinickém prostředí.

Design výzkumu:

Pacientky podstoupí IVF-ICSI podle klinické indikace s plánem zmrazit všechna embrya pro odložený přenos embryí. Kultivace embryí bude probíhat podle rutinních protokolů a selekce embryí pro přenos bude provedena pomocí standardních morfologických kritérií. SCM ze všech blastocyst, které se zdají být životaschopné, bude odebrán a odeslán do referenční laboratoře (sekvence 46). Vzorky budou zcela zbaveny identifikace informací o pacientovi a budou označeny přístupovým číslem. Analýza NI-PGT-A bude provedena pomocí komerční soupravy podle doporučení výrobce, přičemž technici budou zaslepeni klinickými výsledky. Když se pacientky vrátí na cyklus přenosu embrya, bude pro přípravu endometria následovat rutinní klinický protokol. Jedno embryo bude vybráno podle rutinních kritérií morfologického třídění a přenos embrya bude proveden standardními technikami. Počáteční výsledek těhotenství bude dokumentován testem hCG v séru. Pokud je test hCG pozitivní, časná gravidita bude potvrzena ultrazvukovým vyšetřením podle klinické rutiny. Poté, co všichni pacienti dokončí léčbu a projeví se klinické výsledky (neúspěšná implantace, potrat nebo pokračující těhotenství (definované jako životaschopnost po 13 týdnech), výsledky NI-PGT-A budou uvolněny klinickému týmu a korelovány s klinickými výsledky pro výpočet prediktivní hodnoty. Všem probíhajícím těhotenstvím bude nabídnut rutinní prenatální screening na fetální aneuploidii.

Další podrobnosti týkající se laboratorních protokolů jsou následující:

Kultivace blastocyst Kultivace embryí se bude řídit rutinními protokoly. V den 3 po oplodnění budou embrya opakovaně pipetována přes řadu kapiček kultivačního média, aby se snížila možnost kontaminace mateřských buněk. Embrya pak budou jednotlivě kultivována v 35µL kapkách média pro kultivaci embryí do stadia blastocysty. V den 5 nebo den 6 bude vývoj a kvalita blastocyst hodnocena pomocí standardních morfologických kritérií.

Odběr vzorků a vitrifikace blastocyst Kultivační médium blastocyst (20 ul) z vybraných embryí bude odebráno a přeneseno do PCR zkumavek a skladováno při -20 °C až do amplifikace celého genomu (WGA). Blastocysty budou zmrazeny pomocí rutinního vitrifikačního protokolu a uloženy v kapalném dusíku podle rutinního klinického protokolu. Vzorky budou před odesláním do referenční laboratoře zcela zbaveny identifikace informací o pacientovi a označeny přístupovým číslem (Sequence46).

Amplifikace celého genomu a sekvenování DNA Analýza NI-PGT-A bude provedena po obdržení za použití komerční soupravy podle doporučení výrobce, přičemž technici budou zaslepeni klinickými výsledky. DNA bude amplifikována celogenomovou amplifikací (WGA) a čárovým kódem pro přípravu knihoven. Knihovny se poté načtou do přístroje Ion Chef pro přípravu templátu automatickou klonální amplifikací a poté se načtou na čip pro sekvenování DNA na systému Ion Genestudio S5 Prime s přibližně 150 000-200 000 čteními sekvenování na vzorek. Data jsou analyzována pomocí softwaru Ion Reporter (v5.10 nebo novější). Ploidy bude měřena pomocí základní linie, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline. Budou vyhodnocena standardní opatření kontroly kvality. Výsledky budou předány klinickému týmu 6 týdnů po přenosu embrya a budou korelovány s klinickými výsledky pro výpočet prediktivních hodnot.

Populace pacientů:

Kritéria pro zařazení:

Pacientka podstupující IVF-ICSI ve věku 21 - 35 let v době zápisu Volitelný cyklus zmrazení Plánování transferu jednoho embrya

Kritéria vyloučení:

Absolvování PGT-A, PGT-SR, PGT-M Historie opakovaných těhotenských ztrát Historie opakovaného selhání implantace Plánování transferu více než 1 embrya

Zdůvodněním věkové kategorie je kontrola faktorů souvisejících s věkem jiných než aneuploidie, které mohou ovlivnit implantaci, takže proměnné, které by mohly skládat výpočty prediktivní hodnoty, jsou minimalizovány. Omezení účasti na pacienty do 35 let také optimalizuje selekci embryí tak, že morfologicky normální embrya jsou s největší pravděpodobností zdravá. Kromě toho mají pacienti v této věkové kategorii nejnižší riziko klinických aneuploidií, jako je Downův syndrom.

Správa a ukládání dat:

Výzkumné vzorky budou identifikovány jedinečným přístupovým číslem, ale bez informací identifikujících pacienta. Vzorky budou zpracovány Sequence46 s výsledky spojenými s přírůstkovým číslem. Data budou nahrána prostřednictvím zabezpečené cloudové služby, ke které bude mít přístup primární vyšetřovatel, aby se sloučila s elektronickým formulářem pro hlášení případu (eCRF), který bude uložen lokálně v Olive Fertility Center na šifrovaném pevném disku, který bude zálohován. na sekundárním místním disku. eCRF bude obsahovat jedinečné číslo lékařského záznamu a věk pacienta, ale nebude dokumentovat jméno, datum narození ani žádné jiné identifikační údaje. Výsledky analýzy NI-PGT-A a klinické výsledky budou také uloženy v eCRF.

Údaje z výzkumu budou uchovávány po dobu 5 let od data zveřejnění.

Statistická analýza:

Diagnostická přesnost bude interpretována v kontextu pozitivních a negativních prediktivních hodnot.

Pozitivním výsledkem je nález odpovídající aneuploidii nebo mozaikovitosti. Negativním výsledkem je nález odpovídající euploidii.

PPV = (Neúspěšná implantace + potrat + klinická aneuploidie)/ Všechny pozitivní výsledky NPV = Pokračující těhotenství / Všechny negativní výsledky

Vzorový výpočet velikosti:

Pro tuto pilotní studii by mělo stačit sto dvacet (120) pacientů. Předchozí výzkum prokázal, že u pacientů ve věku 35 let nebo mladších je poměr euploidních:aneuploidních embryí přibližně 60:40. Z euploidních embryí se přibližně 70 % implantuje, z nichž 85 % by mělo pokračovat v životaschopnosti. Z aneuploidních embryí se přibližně 25 % implantuje, z toho > 99 % potratí; riziko klinické aneuploidie je méně než 0,5 % u žen do 35 let.

Vzhledem k těmto pravděpodobnostem se ze 120 pacientek, které mají být zařazeny, očekává 72 euploidních embryí, z nichž 50 by se mělo implantovat a 43 bude pokračovat jako pokračující životaschopná těhotenství. Ze 48, u kterých se očekává, že budou aneuploidní, se 12 implantuje, z nichž všichni by měli potratit (šance na klinickou aneuploidii u této populace je menší než 0,5 %).

Nábor:

Pacienti, kteří se zabývají IVF-ICSI v Olive Fertility Center a splňují kritéria pro zařazení/vyloučení, budou rekrutováni přímo spoluřešiteli. Letáky budou vyvěšeny na klinice.