Nieinwazyjne badanie przesiewowe chromosomów w celu selekcji zarodków (NICEST)

Hipoteza:

Analiza DNA wolnego od komórek (cfDNA) uwolnionego z rozwijających się zarodków do zużytej pożywki hodowlanej (SCM) może służyć jako nieinwazyjna metoda przeprowadzania przedimplantacyjnych badań genetycznych w kierunku aneuploidii (PGT-A). Badanie bez selekcji, które porównuje wyniki kliniczne z wynikami NI-PGT-A przeniesionych zarodków w sposób zaślepiony, scharakteryzuje dokładność diagnostyczną poprzez określenie dodatnich i ujemnych wartości predykcyjnych

Uzasadnienie:

Podczas procesu zapłodnienia in vitro (IVF) wybór zdrowego zarodka jest ograniczony przez niezdolność obrazu mikroskopowego do ujawnienia dopełniacza chromosomalnego. Dlatego też, aby wiarygodnie wyselekcjonować zarodki o prawidłowym chromosomie, wykonuje się przedimplantacyjne badanie genetyczne w kierunku aneuploidii (PGT-A). PGT-A wymaga biopsji zarodka, amplifikacji DNA, a następnie sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w celu określenia liczby kopii chromosomu.

Chociaż wykazano przydatność kliniczną PGT-A, proces ten ma ograniczenia, z których najważniejszym jest konieczność wykonania biopsji zarodka. Zazwyczaj 5-10 komórek usuwa się z TE po naruszeniu osłonki przejrzystej. Chociaż procedura może być bezpiecznie i skutecznie przeprowadzona przez przeszkolonych embriologów, istotna jest oczywista obawa o uszkodzenie zarodka. Nawet jeśli implantacja przebiegnie pomyślnie, pojawiły się obawy, że biopsja zarodka na tym etapie może prowadzić do powikłań, takich jak poronienie lub problemy z funkcją łożyska w późniejszym okresie ciąży. Ponadto, ponieważ przeznaczeniem TE jest różnicowanie się do łożyska, a nie do samego płodu, istnieją kontrowersje dotyczące tego, czy analiza chromosomalna tych komórek jest zawsze reprezentatywna dla chromosomalnego dopełnienia płodu. Z tych powodów oraz ponieważ biopsja TE jest pracochłonna i kosztowna, PGT-A nadal nie wyparła oceny morfologicznej jako klinicznego standardu selekcji zarodków.

Idealna byłaby dokładna nieinwazyjna metoda badania aneuploidii zarodków przed implantacją. W tym celu opracowywanie nieinwazyjnych metod PGT-A (NI-PGT-A) jest obszarem aktywnych badań. Podejście to wykorzystuje zdolność do izolowania wolnego od komórek DNA (cfDNA), które jest wydzielane z blastocysty do zużytej pożywki hodowlanej (SCM). SCM jest rutynowo odrzucane po usunięciu zarodka z hodowli, jednak niewielkie ilości DNA z zarodka można wyizolować, powielić, a następnie zsekwencjonować w celu analizy liczby kopii chromosomów. Oczywistą zaletą jest to, że proces ten może zachodzić bez szkody dla zarodka. Dodatkową przypuszczalną korzyścią tego nieinwazyjnego podejścia jest to, że DNA jest wydzielane zarówno z TE, jak i wewnętrznej masy komórkowej (ICM), teoretycznie służąc jako dokładniejsza reprezentacja kariotypu płodu niż DNA wyizolowane z samej biopsji TE.

Ograniczenia techniczne wdrażania NI-PGT-A są związane z ograniczoną ilością DNA dostępnego w SCM. W przeciwieństwie do innych metod badań genetycznych, w których duże ilości materiału genetycznego są łatwo ekstrahowane z krwi, płynu owodniowego lub biopsji tkanki, wydzielanie wolnego od komórek DNA z blastocyst jest wyjątkowo niewielkie pod względem ilości. Jednak protokoły laboratoryjne szybko się rozwijają, o czym świadczą liczne publikacje, które wykazały już wysoki poziom spójności, gdy liczba kopii chromosomów jest analizowana równolegle przez NI-PGT-A i tradycyjną PGT-A.

Chociaż badania te zilustrowały dowód koncepcji i walidację przedkliniczną, prawdziwą dokładność diagnostyczną można ocenić jedynie poprzez ocenę wartości predykcyjnej wyników ujemnych (euploidalnych) i dodatnich (aneuploidalnych). W szczególności zarodki uznane za euploidalne powinny mieć większą zdolność do trwałej implantacji, która prowadzi do żywych narodzin, podczas gdy zarodki aneuploidalne powinny mieć dramatycznie niższy wskaźnik trwałej implantacji lub będą przewidywać kliniczną aneuploidię. Bez rygorystycznej walidacji klinicznej wykorzystanie tych wyników do selekcji zarodków może prowadzić do błędnej diagnozy, powodując selekcję niezdrowych zarodków lub selekcję zarodków, które mogłyby być potencjalnie żywotne.

Aby określić, czy NI-PGT-A jest klinicznie odporny, proponujemy badanie pilotażowe bez selekcji, w którym selekcja zarodków jest przeprowadzana rutynowymi metodami klinicznymi (tj. selekcja morfologiczna). Jednak po pojawieniu się wyniku klinicznego SCM zostanie przeanalizowany za pomocą dostępnych na rynku protokołów NI-PGT-A w sposób zaślepiony. Korelując wyniki kliniczne z wynikami NI-PGT-A, można obliczyć dodatnie i ujemne wartości predykcyjne bez błędu systematycznego. Ponieważ nie zostanie przeprowadzona żadna interwencja odbiegająca od rutyny klinicznej, zarodek ani rodzic nie będą narażeni na żadne dodatkowe ryzyko.

Badanie to posłuży jako pilotaż dla ewentualnych przyszłych prób. Jeśli wykazano rozsądną wartość predykcyjną NI-PGT-A, prospektywne badanie selekcyjne może być uzasadnione w celu zbadania użyteczności NI-PGT-A w warunkach klinicznych.

Projekt badawczy:

Pacjenci zostaną poddani IVF-ICSI zgodnie ze wskazaniem klinicznym, z planami zamrożenia wszystkich zarodków w celu odroczonego transferu zarodków. Hodowla zarodków będzie przebiegać zgodnie z rutynowymi protokołami, a selekcja zarodków do transferu zostanie przeprowadzona przy użyciu standardowych kryteriów morfologicznych. SCM ze wszystkich blastocyst, które wydają się zdolne do życia, zostanie pobrany i wysłany do laboratorium referencyjnego (sekwencja 46). Próbki zostaną całkowicie pozbawione danych identyfikacyjnych pacjenta i oznaczone numerem dostępu. Analiza NI-PGT-A zostanie przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z zaleceniami producenta, z technikami nie znającymi wyników klinicznych. Gdy pacjentki powrócą na cykl transferu zarodków, podczas przygotowania endometrium przestrzegany będzie rutynowy protokół kliniczny. Pojedynczy zarodek zostanie wybrany zgodnie z rutynowymi kryteriami klasyfikacji morfologicznej, a transfer zarodka zostanie przeprowadzony przy użyciu standardowych technik. Początkowy wynik ciąży zostanie udokumentowany badaniem hCG w surowicy. Jeśli test hCG jest pozytywny, wczesna ciąża zostanie potwierdzona badaniem ultrasonograficznym zgodnie z rutynową praktyką kliniczną. Po zakończeniu leczenia wszystkich pacjentek i wykazaniu wyników klinicznych (nieudana implantacja, poronienie lub trwająca ciąża (zdefiniowana jako żywotność powyżej 13 tygodni), wyniki NI-PGT-A zostaną udostępnione zespołowi klinicznemu i skorelowane z wynikami klinicznymi w celu obliczenia predykcyjnego wartości. Wszystkim kobietom w toku ciąży zostanie zaproponowane rutynowe badanie prenatalne pod kątem aneuploidii płodu.

Dodatkowe szczegóły dotyczące protokołów laboratoryjnych są następujące:

Hodowla blastocyst Hodowla zarodków będzie zgodna z rutynowymi protokołami. Trzeciego dnia po zapłodnieniu zarodki będą wielokrotnie pipetowane przez serię kropel pożywki hodowlanej, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia komórkami matczynymi. Zarodki będą następnie hodowane indywidualnie w 35 µl kropli pożywki do hodowli zarodków do stadium blastocysty. W dniu 5 lub 6, rozwój i jakość blastocysty zostaną ocenione przy użyciu standardowych kryteriów morfologicznych.

Pobieranie próbek i witryfikacja blastocyst Pożywka do hodowli blastocyst (20µl) z wybranych zarodków zostanie pobrana i przeniesiona do probówek PCR i przechowywana w -20°C do amplifikacji całego genomu (WGA). Blastocysty zostaną zamrożone zgodnie z rutynowym protokołem witryfikacji i przechowywane w ciekłym azocie zgodnie z rutynowym protokołem klinicznym. Próbki zostaną całkowicie pozbawione elementów umożliwiających identyfikację pacjenta i oznaczone numerem dostępu przed wysyłką do laboratorium referencyjnego (Sekwencja 46).

Amplifikacja całego genomu i sekwencjonowanie DNA Analiza NI-PGT-A zostanie przeprowadzona po otrzymaniu, przy użyciu komercyjnego zestawu zgodnie z zaleceniami producenta, z technikami nie znającymi wyników klinicznych. DNA zostanie zamplifikowane przez amplifikację całego genomu (WGA) i kodowane kodami kreskowymi w celu przygotowania bibliotek. Biblioteki są następnie ładowane do instrumentu Ion Chef w celu przygotowania matrycy przez zautomatyzowaną amplifikację klonalną, a następnie ładowane na chip do sekwencjonowania DNA w systemie Ion Genestudio S5 Prime, z około 150 000-200 000 odczytów sekwencjonowania na próbkę. Dane są analizowane przy użyciu oprogramowania Ion Reporter (wersja 5.10 lub nowsza). Ploidia będzie mierzona przy użyciu linii podstawowej, linii bazowej Ion ReproSeq o niskim pokryciu całego genomu (99M). Ocenione zostaną standardowe środki kontroli jakości. Wyniki zostaną przekazane zespołowi klinicznemu 6 tygodni po transferze zarodka i skorelowane z wynikami klinicznymi w celu obliczenia wartości predykcyjnych.

Populacja pacjentów:

Kryteria przyjęcia:

Pacjentka poddawana zabiegowi IVF-ICSI Wiek 21–35 lat w momencie rejestracji Planowanie cyklu zamrożenia całego zarodka Planowanie transferu pojedynczego zarodka

Kryteria wyłączenia:

W trakcie PGT-A, PGT-SR, PGT-M Historia nawracających poronień Historia nawracających niepowodzeń implantacji Planowanie transferu więcej niż 1 zarodka

Uzasadnieniem dla kategorii wiekowej jest kontrola czynników związanych z wiekiem innych niż aneuploidia, które mogą wpływać na implantację, tak aby zminimalizować zmienne, które mogłyby łączyć obliczenia wartości predykcyjnej. Ograniczenie udziału do pacjentów poniżej 35 roku życia również optymalizuje selekcję zarodków, tak aby zarodki o prawidłowej morfologii były najprawdopodobniej zdrowe. Ponadto pacjenci w tej kategorii wiekowej mają najniższe ryzyko klinicznych aneuploidii, takich jak zespół Downa.

Zarządzanie i przechowywanie danych:

Próbki badawcze będą identyfikowane za pomocą unikalnego numeru dostępu, ale bez informacji identyfikujących pacjenta. Próbki zostaną przetworzone przez Sequence46 z wynikami powiązanymi z numerem dostępu. Dane zostaną przesłane za pośrednictwem bezpiecznej usługi w chmurze, do której główny badacz uzyska dostęp w celu połączenia z elektronicznym formularzem opisu przypadku (eCRF), który będzie przechowywany lokalnie w Olive Fertility Center na zaszyfrowanym dysku twardym, którego kopia zapasowa będzie na drugorzędnym dysku lokalnym. eCRF będzie zawierał unikalny numer dokumentacji medycznej i wiek pacjenta, ale nie będzie zawierał imienia i nazwiska, daty urodzenia ani żadnych innych informacji identyfikujących. Wyniki analizy NI-PGT-A i wynik kliniczny będą również przechowywane w eCRF.

Dane badawcze będą przechowywane przez 5 lat od daty publikacji.

Analiza statystyczna:

Trafność diagnostyczna będzie interpretowana w kontekście dodatnich i ujemnych wartości predykcyjnych.

Wynik pozytywny to stwierdzenie zgodne z aneuploidią lub mozaicyzmem. Wynik ujemny jest wynikiem zgodnym z euploidią.

PPV = (nieudana implantacja + poronienie + aneuploidia kliniczna)/ wszystkie wyniki pozytywne NPV = ciąża w toku / wszystkie wyniki ujemne

Obliczenie wielkości próbki:

Do tego badania pilotażowego powinno wystarczyć stu dwudziestu (120) pacjentów. Wcześniejsze badania wykazały, że u pacjentów w wieku 35 lat lub młodszych stosunek zarodków euploidalnych do aneuploidalnych wynosi około 60:40. Spośród euploidalnych zarodków około 70% zagnieżdża się, z czego 85% powinno zachować żywotność. Spośród zarodków aneuploidalnych około 25% zagnieżdża się, z czego > 99% poroni; ryzyko klinicznej aneuploidii jest mniejsze niż 0,5% u kobiet w wieku 35 lat i młodszych.

Biorąc pod uwagę te prawdopodobieństwa, spośród 120 pacjentów, które mają zostać włączone, oczekuje się 72 euploidalnych zarodków, z których 50 powinno się zagnieździć, a 43 będzie kontynuowanych jako trwające, żywotne ciąże. Spośród 48, które prawdopodobnie będą aneuploidami, 12 ulegnie implantacji, z których wszystkie powinny zakończyć się poronieniem (szansa na kliniczną aneuploidię w tej populacji jest mniejsza niż 0,5%).

Rekrutacja:

Pacjenci, którzy realizują IVF-ICSI w Olive Fertility Center i spełniają kryteria włączenia/wyłączenia, będą rekrutowani bezpośrednio przez współbadaczy. Ulotki zostaną wywieszone na terenie kliniki.