Неинвазивный хромосомный скрининг для отбора эмбрионов (NICEST)

Гипотеза:

Анализ внеклеточной ДНК (вкДНК), высвобождаемой из развивающихся эмбрионов в отработанные питательные среды (СКМ), может служить неинвазивным методом проведения преимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию (ПГТ-А). Исследование без отбора, в котором клинические исходы сравниваются с результатами NI-PGT-A перенесенных эмбрионов вслепую, будет характеризовать точность диагностики путем определения положительных и отрицательных прогностических значений.

Обоснование:

Во время процесса экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) выбор здорового эмбриона ограничен невозможностью микроскопического исследования выявить хромосомный набор. Таким образом, для достоверного отбора хромосомно нормальных эмбрионов проводят преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидию (ПГТ-А). PGT-A требует биопсии эмбриона, амплификации ДНК, затем секвенирования следующего поколения (NGS) для определения количества копий хромосом.

Хотя клиническая полезность PGT-A была продемонстрирована, этот процесс имеет ограничения, наиболее существенным из которых является необходимость биопсии эмбриона. Как правило, 5-10 клеток удаляют из ТЭ после нарушения прозрачной зоны. В то время как процедура может быть безопасно и эффективно выполнена обученными эмбриологами, существует очевидная опасность повреждения эмбриона. Даже если имплантация происходит успешно, высказывались опасения, что биопсия эмбриона на этой стадии может привести к таким осложнениям, как выкидыш или проблемы с плацентарной функцией на более поздних сроках беременности. Кроме того, поскольку TE предназначена для дифференцировки в плаценту, а не в сам плод, существуют разногласия относительно того, всегда ли хромосомный анализ этих клеток репрезентативен для хромосомного набора плода. По этим причинам, а также из-за трудоемкости и дороговизны ТЭ-биопсии PGT-A до сих пор не заменила морфологическую оценку в качестве клинического стандарта отбора эмбрионов.

Точный неинвазивный метод скрининга эмбрионов на анеуплоидию перед имплантацией был бы идеальным. С этой целью разработка неинвазивных методов PGT-A (NI-PGT-A) является областью активных исследований. Этот подход использует возможность выделения бесклеточной ДНК (вкДНК), которая секретируется из бластоцисты в отработанную культуральную среду (СКМ). SCM обычно выбрасывают после того, как эмбрион был удален из культуры, однако небольшие количества ДНК из эмбриона могут быть выделены, амплифицированы, а затем секвенированы для анализа числа копий хромосомы. Очевидным преимуществом является то, что этот процесс может происходить без вреда для эмбриона. Дополнительным предполагаемым преимуществом этого неинвазивного подхода является то, что ДНК секретируется как из TE, так и из внутренней клеточной массы (ICM), что теоретически служит более точным представлением кариотипа плода, чем ДНК, выделенная только из биопсии TE.

Технические ограничения развертывания NI-PGT-A связаны с ограниченным количеством ДНК, доступной в SCM. В отличие от других методов генетического тестирования, при которых достаточное количество генетического материала легко извлекается из крови, амниотической жидкости или биопсии ткани, бесклеточная секреция ДНК из бластоцисты является исключительно незначительной. Однако лабораторные протоколы быстро развиваются, о чем свидетельствуют многочисленные публикации, которые уже продемонстрировали высокий уровень согласованности при параллельном анализе числа копий хромосом с помощью NI-PGT-A и традиционного PGT-A.

Хотя эти исследования иллюстрировали доказательство концепции и доклиническую проверку, истинная диагностическая точность может быть оценена только путем оценки прогностической ценности отрицательных (эуплоидных) и положительных (анеуплоидных) результатов. В частности, эмбрионы, признанные эуплоидными, должны иметь большую способность к устойчивой имплантации, которая приводит к живорождению, в то время как анеуплоидные эмбрионы должны иметь значительно более низкую скорость устойчивой имплантации или будут предсказывать клиническую анеуплоидию. Без строгой клинической проверки использование этих результатов для отбора эмбрионов может привести к неправильной диагностике, вызывая отбор нездоровых эмбрионов или отбор эмбрионов, которые могли бы быть потенциально жизнеспособными.

Чтобы определить, является ли NI-PGT-A клинически надежным, мы предлагаем пилотное исследование без отбора, в котором отбор эмбрионов осуществляется обычными клиническими методами (т. е. морфологическим отбором). Однако после проявления клинического результата SCM будет проанализирован с помощью имеющихся в продаже протоколов NI-PGT-A слепым методом. Сопоставляя клинические результаты с результатами NI-PGT-A, положительные и отрицательные прогностические значения могут быть рассчитаны без смещения. Поскольку никакое вмешательство, отклоняющееся от клинической рутины, выполняться не будет, никакого дополнительного риска для эмбриона или родителя не будет.

Это исследование послужит пилотом для возможных будущих испытаний. Если будет продемонстрирована разумная прогностическая ценность NI-PGT-A, можно было бы оправдать проспективное выборочное исследование для изучения полезности NI-PGT-A в клинических условиях.

Дизайн исследования:

Пациенты будут проходить ЭКО-ИКСИ по клиническим показаниям с планами замораживания всех эмбрионов для отложенного переноса эмбрионов. Культивирование эмбрионов будет проводиться в соответствии с обычными протоколами, а отбор эмбрионов для переноса будет осуществляться с использованием стандартных морфологических критериев. СКМ из всех жизнеспособных бластоцист будет собрана и отправлена ​​в референс-лабораторию (последовательность 46). Образцы будут полностью лишены информации о пациенте и помечены инвентарным номером. Анализ NI-PGT-A будет выполняться с использованием коммерческого набора в соответствии с рекомендациями производителя, при этом технические специалисты не будут знать о клинических результатах. Когда пациенты возвращаются для цикла переноса эмбрионов, для подготовки эндометрия будет соблюдаться обычный клинический протокол. Один эмбрион будет выбран в соответствии с обычными критериями морфологической оценки, и перенос эмбриона будет выполнен с использованием стандартных методов. Первоначальный исход беременности будет задокументирован с помощью теста на ХГЧ в сыворотке крови. Если анализ на ХГЧ положительный, ранняя беременность будет подтверждена с помощью ультразвукового исследования в соответствии с клинической практикой. После того, как все пациенты завершили лечение и проявились клинические результаты (неудачная имплантация, выкидыш или продолжающаяся беременность (определяемая как жизнеспособность более 13 недель), результаты NI-PGT-A будут переданы клинической команде и сопоставлены с клиническими результатами для расчета прогностических результатов. ценности. Всем текущим беременностям будет предложен рутинный пренатальный скрининг на анеуплоидии плода.

Дополнительные сведения о лабораторных протоколах приведены ниже:

Культура бластоцисты Культура эмбрионов будет следовать обычным протоколам. На 3-й день после оплодотворения эмбрионы будут повторно пипетированы через серию капель культуральной среды, чтобы снизить вероятность загрязнения материнскими клетками. Затем эмбрионы будут индивидуально культивироваться в каплях 35 мкл среды для культивирования эмбрионов до стадии бластоцисты. На 5-й или 6-й день развитие и качество бластоцисты оценивают с использованием стандартных морфологических критериев.

Сбор образцов и витрификация бластоцист Среда для культивирования бластоцист (20 мкл) от выбранных эмбрионов будет собрана и перенесена в пробирки для ПЦР и сохранена при -20°C до полной амплификации генома (WGA). Бластоцисты будут заморожены в соответствии с обычным протоколом витрификации и сохранены в жидком азоте в соответствии с обычным клиническим протоколом. Перед отправкой в ​​референс-лабораторию образцы будут полностью деидентифицированы в отношении информации о пациенте и помечены инвентарным номером (Sequence46).

Полногеномная амплификация и секвенирование ДНК. Анализ NI-PGT-A будет проводиться после получения с использованием коммерческого набора в соответствии с рекомендациями производителя, при этом технические специалисты не будут знать о клинических результатах. ДНК будет амплифицирована методом полногеномной амплификации (WGA) и штрих-кодирована для подготовки библиотек. Затем библиотеки загружаются в прибор Ion Chef для подготовки матриц путем автоматической клональной амплификации, а затем загружаются в чип для секвенирования ДНК в системе Ion Genestudio S5 Prime с примерно 150 000–200 000 считываний секвенирования на образец. Данные анализируются с использованием программного обеспечения Ion Reporter (версия 5.10 или более поздняя). Плоидность будет измеряться с использованием исходного уровня, базового уровня полного генома Ion ReproSeq с низким охватом (99M). Будут оценены стандартные меры контроля качества. Результаты будут предоставлены клинической команде через 6 недель после переноса эмбрионов и сопоставлены с клиническими исходами для расчета прогностических значений.

Популяция пациентов:

Критерии включения:

Пациент, проходящий ЭКО-ИКСИ Возраст от 21 до 35 лет на момент включения Планирование цикла замораживания всех эмбрионов Планирование переноса одного эмбриона

Критерий исключения:

Прохождение PGT-A, PGT-SR, PGT-M История привычного невынашивания беременности История повторной неудачи имплантации Планирование переноса более 1 эмбриона

Обоснованием возрастной категории является контроль связанных с возрастом факторов, отличных от анеуплоидии, которые могут влиять на имплантацию, поэтому переменные, которые могут усложнить расчеты прогностической ценности, сведены к минимуму. Ограничение участия пациентами моложе 35 лет также оптимизирует отбор эмбрионов, так что морфологически нормальные эмбрионы, скорее всего, будут здоровыми. Кроме того, пациенты этой возрастной категории имеют самый низкий риск развития клинических анеуплоидий, таких как синдром Дауна.

Управление данными и их хранение:

Образцы для исследований будут идентифицированы по уникальному инвентарному номеру, но без информации, идентифицирующей пациента. Образцы будут обработаны Sequence46 с результатами, связанными с инвентарным номером. Данные будут загружаться через безопасный облачный сервис, доступ к которому будет иметь главный исследователь для объединения с электронной формой отчета о случае (eCRF), которая будет храниться локально в Olive Fertility Center на зашифрованном жестком диске с резервной копией. на дополнительный локальный диск. eCRF будет содержать уникальный номер медицинской карты пациента и возраст, но не будет документировать имя, дату рождения или любую другую идентифицирующую информацию. Результаты анализа NI-PGT-A и клинические результаты также будут храниться в eCRF.

Данные исследования будут храниться в течение 5 лет после даты публикации.

Статистический анализ:

Точность диагностики будет интерпретироваться в контексте положительных и отрицательных прогностических значений.

Положительным результатом является обнаружение, согласующееся с анеуплоидией или мозаицизмом. Отрицательный результат соответствует эуплоидии.

PPV = (Неудачная имплантация + выкидыш + клиническая анеуплоидия)/Все положительные результаты NPV = Текущая беременность/Все отрицательные результаты

Расчет размера выборки:

Для этого пилотного исследования должно быть достаточно ста двадцати (120) пациентов. Предыдущие исследования установили, что у пациентов в возрасте 35 лет и моложе соотношение эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов составляет примерно 60:40. Примерно 70% эуплоидных эмбрионов имплантируются, из них 85% сохранят жизнеспособность. Из анеуплоидных эмбрионов примерно 25% имплантируются, из которых >99% приводят к выкидышу; риск клинической анеуплоидии составляет менее 0,5% у женщин 35 лет и младше.

Учитывая эти вероятности, из 120 пациентов, которые будут включены в исследование, ожидается 72 эуплоидных эмбриона, из которых 50 должны имплантироваться, а 43 сохранятся как продолжающиеся жизнеспособные беременности. Из 48 предполагаемых анеуплоидий 12 имплантируются, из них у всех произойдет выкидыш (вероятность клинической анеуплоидии в этой популяции составляет менее 0,5%).

Набор персонала:

Пациенты, которые проходят ЭКО-ИКСИ в Оливковом центре фертильности и соответствуют критериям включения/исключения, будут набраны непосредственно соисследователями. В клинике будут расклеены листовки.