Ikke-invasiv kromosomal screening for embryoseleksjonsforsøk (NICEST)

Hypotese:

Analyse av cellefritt DNA (cfDNA) frigjort fra utviklende embryoer til brukte kulturmedier (SCM) kan tjene som en ikke-invasiv metode for å utføre preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi (PGT-A). En ikke-seleksjonsstudie som sammenligner kliniske resultater med NI-PGT-A-resultatene til de overførte embryoene på en blind måte vil karakterisere den diagnostiske nøyaktigheten ved å bestemme positive og negative prediktive verdier

Berettigelse:

Under in vitro fertiliseringsprosessen (IVF), er valget av et sunt embryo begrenset av det mikroskopiske utseendets manglende evne til å avsløre det kromosomale komplementet. Således, for pålitelig å velge kromosomalt normale embryoer, utføres preimplantasjonsgenetisk testing for aneuploidi (PGT-A). PGT-A krever biopsi av embryoet, amplifisering av DNA, deretter neste generasjons sekvensering (NGS) for å bestemme antall kromosomkopi.

Mens den kliniske nytten av PGT-A har blitt demonstrert, har prosessen begrensninger, hvorav den viktigste er kravet til embryobiopsi. Vanligvis fjernes 5-10 celler fra TE etter at zona pellucida har blitt brutt. Selv om prosedyren kan utføres trygt og effektivt av trente embryologer, er den åpenbare bekymringen for skade på embryoet relevant. Selv om implantasjonen lykkes, har det blitt reist bekymring for at biopsi av embryoet på dette stadiet kan føre til komplikasjoner som spontanabort eller problemer med placentafunksjon senere i svangerskapet. Videre, fordi TE er bestemt til å differensiere til placenta i stedet for selve fosteret, er det kontrovers om hvorvidt kromosomanalysen av disse cellene alltid er representativ for fosterets kromosomkomplement. Av disse grunnene, og fordi TE-biopsi er arbeidskrevende og dyrt, har PGT-A fortsatt ikke erstattet morfologisk evaluering som den kliniske standarden for embryoseleksjon.

En nøyaktig ikke-invasiv metode for aneuploidiscreening av embryoer før implantasjon ville være ideell. For dette formål er utvikling av ikke-invasive PGT-A (NI-PGT-A) metoder et område for aktiv etterforskning. Tilnærmingen utnytter muligheten til å isolere cellefritt DNA (cfDNA) som skilles ut fra blastocysten til det brukte kulturmediet (SCM). SCM kasseres rutinemessig etter at embryoet er fjernet fra kulturen, men små mengder DNA fra embryoet kan isoleres, amplifiseres og deretter sekvenseres for kromosomalt kopiantallsanalyse. Den åpenbare fordelen er at denne prosessen kan skje uten å skade embryoet. En ytterligere antatt fordel med denne ikke-invasive tilnærmingen er at DNA skilles ut fra både TE og den indre cellemassen (ICM), og tjener teoretisk som en mer nøyaktig representasjon av fosterkaryotypen enn DNA isolert fra bare TE-biopsien alene.

Tekniske begrensninger ved distribusjon av NI-PGT-A er relatert til den begrensede mengden DNA som er tilgjengelig i SCM. I motsetning til andre metoder for genetisk testing der store mengder genetisk materiale lett trekkes ut fra blod, fostervann eller vevsbiopsi, er cellefri DNA-sekresjon fra blastocyster eksepsjonelt liten i mengde. Laboratorieprotokoller utvikler seg imidlertid raskt, noe som fremgår av en rekke publikasjoner som allerede har vist et høyt nivå av konsistens når kromosomalt kopiantall analyseres med NI-PGT-A og tradisjonell PGT-A parallelt.

Mens disse studiene har illustrert proof of concept og preklinisk validering, kan den sanne diagnostiske nøyaktigheten bare vurderes ved å evaluere den prediktive verdien av negative (euploide) og positive (aneuploide) resultater. Spesifikt bør embryoer som er funnet å være euploide ha en større evne til vedvarende implantasjon som fortsetter til levende fødsel, mens aneuploide embryoer bør ha en dramatisk lavere frekvens av vedvarende implantering, eller vil være prediktive for klinisk aneuploidi. Uten streng klinisk validering kan bruk av disse resultatene for embryoseleksjon føre til feildiagnostisering, forårsake seleksjon av usunne embryoer, eller seleksjon mot embryoer som potensielt kunne vært levedyktige.

For å avgjøre om NI-PGT-A er klinisk robust, foreslår vi en ikke-seleksjon, pilotstudie, der embryoseleksjon utføres ved rutinemessige kliniske metoder (dvs. morfologisk seleksjon). Etter at det kliniske resultatet har manifestert seg, vil SCM imidlertid bli analysert av en kommersielt tilgjengelig NI-PGT-A-protokoll på en blind måte. Ved å korrelere kliniske utfall til NI-PGT-A-resultater, kan positive og negative prediktive verdier beregnes uten skjevhet. Fordi det ikke vil bli utført intervensjon som avviker fra den kliniske rutinen, vil det ikke utgjøre noen ytterligere risiko for embryoet eller forelderen.

Denne studien vil fungere som en pilot for et mulig fremtidig forsøk. Hvis rimelig prediktiv verdi av NI-PGT-A er demonstrert, kan en prospektiv seleksjonsstudie være berettiget for å undersøke nytten av NI-PGT-A i en klinisk setting.

Forskningsdesign:

Pasienter vil gjennomgå IVF-ICSI per klinisk indikasjon, med planer om å fryse alle embryoer for utsatt embryooverføring. Embryokultur vil følge rutineprotokoller og embryoseleksjon for overføring vil bli utført ved bruk av standard morfologiske kriterier. SCM fra alle blastocyster som virker levedyktige vil bli samlet inn og sendt til et referanselaboratorium (sekvens 46). Prøver vil bli fullstendig avidentifisert for pasientinformasjon og merket med et tilgangsnummer. NI-PGT-A-analyse vil bli utført ved bruk av et kommersielt sett i henhold til produsentens anbefalinger, med teknikere blindet for kliniske utfall. Når pasienter kommer tilbake for embryooverføringssyklusen, vil rutinemessig klinisk protokoll bli fulgt for endometrieforberedelse. Et enkelt embryo vil bli valgt i henhold til rutinemessige morfologiske graderingskriterier, og embryooverføring vil bli utført med standardteknikker. Utfall av første graviditet vil bli dokumentert med serum-hCG-testing. Hvis hCG-testing er positiv, vil tidlig graviditet bekreftes med ultralydvurdering per klinisk rutine. Etter at alle pasienter har fullført behandling og kliniske utfall manifestert (mislykket implantasjon, spontanabort eller pågående graviditet (definert som levedyktighet utover 13 uker), vil NI-PGT-A-resultater bli frigitt til det kliniske teamet og korrelert til kliniske utfall for beregning av prediktiv verdier. Alle pågående svangerskap vil bli tilbudt rutinemessig prenatal screening for føtale aneuploider.

Ytterligere detaljer angående laboratorieprotokoller er som følger:

Blastocystkultur Embryokultur vil følge rutineprotokoller. På dag 3 etter befruktning, vil embryoer pipetteres gjentatte ganger gjennom en serie kulturmediedråper for å redusere potensialet for morscellekontaminering. Embryoer vil deretter bli dyrket individuelt i 35 µL dråper av embryokulturmedium til blastocyststadiet. På dag 5 eller dag 6 vil blastocystutvikling og kvalitet bli evaluert ved bruk av standard morfologiske kriterier.

Prøvetaking og blastocystvitrifisering Blastocystkulturmedium (20 µL) fra utvalgte embryoer vil bli samlet og overført til PCR-rør og lagret ved -20°C inntil helgenomamplifikasjon (WGA). Blastocyster vil bli frosset via rutinemessig vitrifikasjonsprotokoll og lagret i flytende nitrogen i henhold til rutinemessig klinisk protokoll. Prøver vil bli fullstendig avidentifisert for pasientinformasjon og merket med et tilgangsnummer før de sendes til referanselaboratoriet (Sequence46).

Helgenomamplifikasjon og DNA-sekvensering NI-PGT-A-analyse vil bli utført ved mottak, ved bruk av et kommersielt sett i henhold til produsentens anbefalinger, med teknikere blindet for kliniske utfall. DNA vil bli amplifisert ved helgenomamplifikasjon (WGA) og strekkodet for å forberede biblioteker. Bibliotekene blir deretter lastet på et Ion Chef-instrument for malpreparering ved automatisert klonal amplifikasjon og deretter lastet på en chip for DNA-sekvensering på et Ion Genestudio S5 Prime-system, med omtrent 150 000-200 000 sekvenseringslesninger per prøve. Data analyseres ved hjelp av Ion Reporter-programvaren (v5.10 eller nyere). Ploiditet vil bli målt ved å bruke baseline, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline. Standard kvalitetskontrolltiltak vil bli evaluert. Resultatene vil bli frigitt til det kliniske teamet 6 uker etter embryooverføring og korrelert til kliniske utfall for beregning av prediktive verdier.

Pasientpopulasjon:

Inklusjonskriterier:

Pasient som gjennomgår IVF-ICSI 21 - 35 år gammel på registreringstidspunktet Elektiv frysesyklus Planlegging for enkelt embryooverføring

Ekskluderingskriterier:

Gjennomgår PGT-A, PGT-SR, PGT-M Anamnese med tilbakevendende svangerskapstap Anamnese med tilbakevendende implantasjonssvikt Planlegger overføring av mer enn 1 embryo

Begrunnelsen for alderskategorien er å kontrollere for andre aldersrelaterte faktorer enn aneuploidi som kan påvirke implantasjonen, slik at variabler som kan forverre prediktive verdiberegninger minimeres. Å begrense deltakelsen til pasienter under 35 optimaliserer også embryoseleksjon slik at morfologisk normale embryoer mest sannsynlig er friske. Videre har pasienter i denne alderskategorien lavest risiko for kliniske aneuploidier som Downs syndrom.

Databehandling og lagring:

Forskningsprøver vil bli identifisert med et unikt tilgangsnummer, men ingen pasientidentifikasjonsinformasjon. Prøvene vil bli behandlet av Sequence46 med resultater knyttet til tilgangsnummeret. Dataene vil bli lastet opp via en sikker skytjeneste, som primæretterforskeren får tilgang til for å slå seg sammen med det elektroniske saksrapportskjemaet (eCRF) som vil bli lagret lokalt på Olive Fertility Center på en kryptert harddisk som vil bli sikkerhetskopiert. opp på en sekundær lokal stasjon. eCRF vil inneholde pasientens unike journalnummer og alder, men vil ikke dokumentere navn, fødselsdato eller annen identifiserende informasjon. Resultatene av NI-PGT-A-analysen og klinisk utfall vil også bli lagret i eCRF.

Forskningsdata vil bli oppbevart i 5 år etter publiseringsdato.

Statistisk analyse:

Diagnostisk nøyaktighet vil bli tolket i sammenheng med positive og negative prediktive verdier.

Et positivt resultat er et funn forenlig med aneuploidi eller mosaikk. Et negativt resultat er et funn i samsvar med euploidi.

PPV = (mislykket implantasjon + spontanabort + klinisk aneuploidi)/ Alle positive resultater NPV = Pågående graviditet / Alle negative resultater

Eksempelstørrelsesberegning:

Ett hundre og tjue (120) pasienter bør være tilstrekkelig for denne pilotstudien. Tidligere forskning har fastslått at hos pasienter som er 35 år eller yngre, er forholdet mellom euploide:aneuploide embryoer omtrent 60:40. Av euploide embryoer vil omtrent 70 % implanteres, hvorav 85 % bør fortsette til levedyktighet. Av aneuploide embryoer vil omtrent 25 % implantere, hvorav >99 % vil abort; risikoen for en klinisk aneuploidi er mindre enn 0,5 % hos kvinner 35 og under.

Gitt disse sannsynlighetene, av de 120 pasientene som skal registreres, forventes 72 euploide embryoer, hvorav 50 bør implanteres og 43 vil fortsette som pågående, levedyktige svangerskap. Av de 48 som forventes å være aneuploide, vil 12 implantere, hvorav alle bør abortere (sjansen for en klinisk aneuploidi i denne populasjonen er mindre enn 0,5%).

Rekruttering:

Pasienter som følger IVF-ICSI ved Olive Fertility Center og oppfyller inklusjons-/eksklusjonskriterier, vil bli rekruttert direkte av medetterforskerne. Flyers vil bli lagt ut på klinikken.