Triagem cromossômica não invasiva para teste de seleção de embriões (NICEST)

Hipótese:

A análise de DNA livre de células (cfDNA) liberado de embriões em desenvolvimento em meio de cultura gasto (SCM) pode servir como um método não invasivo para realizar testes genéticos pré-implantação para aneuploidia (PGT-A). Um estudo de não seleção que compara os resultados clínicos com os resultados NI-PGT-A dos embriões transferidos de forma cega caracterizará a precisão diagnóstica pela determinação de valores preditivos positivos e negativos

Justificação:

Durante o processo de fertilização in vitro (FIV), a seleção de um embrião saudável é limitada pela incapacidade da aparência microscópica de revelar o complemento cromossômico. Assim, a fim de selecionar de forma confiável embriões cromossomicamente normais, o teste genético pré-implantação para aneuploidia (PGT-A) é realizado. O PGT-A requer biópsia do embrião, amplificação do DNA e sequenciamento de próxima geração (NGS) para determinar o número de cópias do cromossomo.

Embora a utilidade clínica do PGT-A tenha sido demonstrada, o processo tem limitações, sendo a mais significativa a exigência de biópsia do embrião. Normalmente, 5-10 células são removidas do TE após a zona pelúcida ter sido rompida. Embora o procedimento possa ser realizado com segurança e eficácia por embriologistas treinados, a preocupação óbvia com danos ao embrião é relevante. Mesmo que a implantação ocorra com sucesso, foi levantada a preocupação de que a biópsia do embrião nesse estágio possa levar a complicações como aborto espontâneo ou problemas com a função placentária mais tarde na gravidez. Além disso, como o TE é destinado à diferenciação da placenta e não do próprio feto, há controvérsias sobre se a análise cromossômica dessas células é sempre representativa do complemento cromossômico do feto. Por essas razões, e porque a biópsia TE é trabalhosa e cara, o PGT-A ainda não suplantou a avaliação morfológica como padrão clínico para a seleção de embriões.

Um método não invasivo preciso para triagem de aneuploidia de embriões antes da implantação seria ideal. Para esse fim, o desenvolvimento de métodos não invasivos de PGT-A (NI-PGT-A) é uma área de investigação ativa. A abordagem aproveita a capacidade de isolar o DNA livre de células (cfDNA) que é secretado do blastocisto no meio de cultura gasto (SCM). SCM é rotineiramente descartado após o embrião ter sido removido da cultura, no entanto, pequenas quantidades de DNA do embrião podem ser isoladas, amplificadas e então sequenciadas para análise do número de cópias cromossômicas. A vantagem óbvia é que esse processo pode ocorrer sem causar nenhum dano ao embrião. Um benefício adicional dessa abordagem não invasiva é que o DNA é secretado tanto do TE quanto da massa celular interna (ICM), teoricamente servindo como uma representação mais precisa do cariótipo fetal do que o DNA isolado apenas da biópsia TE sozinho.

As limitações técnicas da implantação do NI-PGT-A estão relacionadas à quantidade limitada de DNA disponível no SCM. Ao contrário de outros modos de teste genético em que grandes quantidades de material genético são prontamente extraídas do sangue, líquido amniótico ou biópsia de tecido, a secreção de DNA livre de células de blastocistos é excepcionalmente pequena em quantidade. No entanto, os protocolos laboratoriais estão se desenvolvendo rapidamente, evidenciado por inúmeras publicações que já demonstraram um alto nível de consistência quando o número de cópias cromossômicas é analisado por NI-PGT-A e PGT-A tradicional em paralelo.

Embora esses estudos tenham ilustrado a prova de conceito e a validação pré-clínica, a verdadeira precisão diagnóstica só pode ser avaliada pela avaliação do valor preditivo de resultados negativos (euploides) e positivos (aneuploides). Especificamente, os embriões considerados euploides devem ter uma capacidade maior de implantação sustentada que prossegue até o nascimento, enquanto os embriões aneuploides devem ter uma taxa drasticamente menor de implantação sustentada ou serão preditivos de aneuploidia clínica. Sem validação clínica rigorosa, o uso desses resultados para a seleção de embriões pode levar a erros de diagnóstico, causando seleção de embriões não saudáveis ​​ou seleção contra embriões que poderiam ser potencialmente viáveis.

Para determinar se o NI-PGT-A é clinicamente robusto, propomos um estudo piloto sem seleção, no qual a seleção de embriões é realizada por métodos clínicos de rotina (isto é, seleção morfológica). No entanto, após a manifestação do resultado clínico, o SCM será analisado por protocolos NI-PGT-A comercialmente disponíveis de forma cega. Ao correlacionar os resultados clínicos com os resultados do NI-PGT-A, os valores preditivos positivos e negativos podem ser calculados sem viés. Como nenhuma intervenção será realizada que se desvie da rotina clínica, nenhum risco adicional será apresentado ao embrião ou aos pais.

Este estudo servirá como piloto para possíveis ensaios futuros. Se um valor preditivo razoável de NI-PGT-A for demonstrado, um estudo prospectivo de seleção pode ser justificado para investigar a utilidade de NI-PGT-A em um ambiente clínico.

Projeto de pesquisa:

Os pacientes serão submetidos a FIV-ICSI por indicação clínica, com planos de congelar todos os embriões para transferência adiada de embriões. A cultura de embriões seguirá protocolos de rotina e a seleção de embriões para transferência será realizada usando critérios morfológicos padrão. SCM de todos os blastocistos que parecem viáveis ​​serão coletados e enviados para um laboratório de referência (Sequência 46). As amostras serão completamente desidentificadas das informações do paciente e rotuladas com um número de acesso. A análise NI-PGT-A será realizada usando um kit comercial de acordo com as recomendações do fabricante, com técnicos cegos para os resultados clínicos. Quando as pacientes retornarem para o ciclo de transferência de embriões, o protocolo clínico de rotina será seguido para a preparação do endométrio. Um único embrião será selecionado de acordo com critérios de classificação morfológica de rotina, e a transferência de embriões será realizada com técnicas padrão. O resultado inicial da gravidez será documentado com teste de hCG sérico. Se o teste de hCG for positivo, a gravidez precoce será confirmada com avaliação ultrassonográfica de acordo com a rotina clínica. Depois que todos os pacientes concluírem o tratamento e os resultados clínicos se manifestarem (falha na implantação, aborto espontâneo ou gravidez contínua (definida como viabilidade além de 13 semanas), os resultados do NI-PGT-A serão liberados para a equipe clínica e correlacionados aos resultados clínicos para cálculo de preditivo valores. Todas as gestações em andamento receberão triagem pré-natal de rotina para aneuploidias fetais.

Detalhes adicionais sobre os protocolos laboratoriais são os seguintes:

Cultura de blastocistos A cultura de embriões seguirá os protocolos de rotina. No dia 3 após a fertilização, os embriões serão repetidamente pipetados através de uma série de gotículas de meios de cultura para reduzir o potencial de contaminação das células maternas. Os embriões serão então cultivados individualmente em gotas de 35µL de meio de cultura de embriões até o estágio de blastocisto. No dia 5 ou dia 6, o desenvolvimento e a qualidade do blastocisto serão avaliados usando critérios morfológicos padrão.

Coleta de amostras e vitrificação de blastocistos O meio de cultura de blastocistos (20µL) de embriões selecionados será coletado e transferido para tubos de PCR e armazenados a -20°C até a amplificação completa do genoma (WGA). Os blastocistos serão congelados por meio do protocolo de vitrificação de rotina e armazenados em nitrogênio líquido de acordo com o protocolo clínico de rotina. As amostras serão completamente desidentificadas das informações do paciente e rotuladas com um número de acesso antes do envio para o laboratório de referência (Sequência 46).

A análise de amplificação do genoma total e sequenciamento de DNA NI-PGT-A será realizada no recebimento, usando um kit comercial de acordo com as recomendações do fabricante, com técnicos cegos para os resultados clínicos. O DNA será amplificado por amplificação do genoma inteiro (WGA) e código de barras para preparar bibliotecas. As bibliotecas são carregadas em um instrumento Ion Chef para preparação de modelo por amplificação clonal automatizada e, em seguida, carregadas em um chip para sequenciamento de DNA em um sistema Ion Genestudio S5 Prime, com aproximadamente 150.000-200.000 leituras de sequenciamento por amostra. Os dados são analisados ​​usando o software Ion Reporter (v5.10 ou posterior). A ploidia será medida usando linha de base, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline. Medidas padrão de controle de qualidade serão avaliadas. Os resultados serão liberados para a equipe clínica 6 semanas após a transferência do embrião e correlacionados com os resultados clínicos para cálculo de valores preditivos.

População de pacientes:

Critério de inclusão:

Paciente submetido a FIV-ICSI 21 - 35 anos de idade no momento da inscrição Ciclo eletivo de congelar tudo Planejamento para transferência de embrião único

Critério de exclusão:

Passando por PGT-A, PGT-SR, PGT-M História de perda recorrente de gravidez História de falha de implantação recorrente Planejando a transferência de mais de 1 embrião

A justificativa para a categoria de idade é controlar os fatores relacionados à idade, além da aneuploidia, que podem influenciar a implantação, de modo que as variáveis ​​que poderiam compor os cálculos do valor preditivo sejam minimizadas. Limitar a participação a pacientes com menos de 35 anos também otimiza a seleção de embriões, de modo que os embriões morfologicamente normais sejam provavelmente saudáveis. Além disso, os pacientes nesta faixa etária têm o menor risco de aneuploidias clínicas, como a síndrome de Down.

Gerenciamento e armazenamento de dados:

As amostras de pesquisa serão identificadas por um número de acesso exclusivo, mas nenhuma informação de identificação do paciente. As amostras serão processadas pela Sequence46 com resultados associados ao número de acesso. Os dados serão carregados por meio de um serviço de nuvem seguro, que será acessado pelo investigador principal para mesclar com o formulário eletrônico de relatório de caso (eCRF) que será armazenado localmente no Olive Fertility Center em um disco rígido criptografado que será apoiado- em uma unidade local secundária. A eCRF conterá o número e a idade do registro médico exclusivo do paciente, mas não documentará o nome, a data de nascimento ou qualquer outra informação de identificação. Os resultados da análise NI-PGT-A e o resultado clínico também serão armazenados no eCRF.

Os dados da pesquisa serão retidos por 5 anos após a data de publicação.

Análise estatística:

A precisão diagnóstica será interpretada no contexto de valores preditivos positivos e negativos.

Um resultado positivo é um achado consistente com aneuploidia ou mosaicismo. Um resultado negativo é um achado consistente com euploidia.

VPP = (falha na implantação + aborto espontâneo + aneuploidia clínica)/Todos os resultados positivos NPV = Gravidez em curso/Todos os resultados negativos

Cálculo do tamanho da amostra:

Cento e vinte (120) pacientes devem ser suficientes para este estudo piloto. Pesquisas anteriores estabeleceram que em pacientes com 35 anos ou menos, a proporção de embriões euploides:aneuploides é de aproximadamente 60:40. Dos embriões euploides, aproximadamente 70% irão implantar, dos quais, 85% devem continuar a viabilidade. Dos embriões aneuplóides, aproximadamente 25% irão implantar, dos quais >99% abortarão; o risco de aneuploidia clínica é inferior a 0,5% em mulheres com 35 anos ou menos.

Dadas essas probabilidades, dos 120 pacientes a serem incluídos, 72 embriões euplóides são esperados, dos quais 50 devem ser implantados e 43 continuarão como gestações viáveis ​​em andamento. Dos 48 que se espera serem aneuploidias, 12 irão implantar, dos quais todos devem abortar (a chance de uma aneuploidia clínica nesta população é inferior a 0,5%).

Recrutamento:

Os pacientes que estão buscando FIV-ICSI no Olive Fertility Center e atendem aos critérios de inclusão/exclusão serão recrutados diretamente pelos coinvestigadores. Folhetos serão afixados dentro da clínica.