Noninvazív kromoszómaszűrés az embriószelekciós kísérlethez (NICEST)

Hipotézis:

A fejlődő embriókból kimerült táptalajba (SCM) felszabaduló sejtmentes DNS (cfDNS) elemzése non-invazív módszerként szolgálhat az aneuploidia (PGT-A) preimplantációs genetikai vizsgálatához. Egy nem szelekciós vizsgálat, amely a klinikai eredményeket az átvitt embriók NI-PGT-A eredményeivel vak módszerrel hasonlítja össze, a diagnosztikai pontosságot pozitív és negatív prediktív értékek meghatározásával jellemzi.

Indokolás:

Az in vitro megtermékenyítési (IVF) folyamat során az egészséges embrió kiválasztását korlátozza, hogy a mikroszkopikus megjelenés nem képes feltárni a kromoszómális komplementet. Így a kromoszómálisan normális embriók megbízható szelekciója érdekében az aneuploidia (PGT-A) preimplantációs genetikai vizsgálatát végezzük. A PGT-A megköveteli az embrió biopsziáját, a DNS amplifikációját, majd a következő generációs szekvenálást (NGS) a kromoszóma kópiaszámának meghatározásához.

Noha a PGT-A klinikai hasznosságát igazolták, a folyamatnak vannak korlátai, amelyek közül a legjelentősebb az embrióbiopszia szükségessége. Jellemzően 5-10 sejtet távolítanak el a TE-ből a zona pellucida áttörése után. Bár az eljárást képzett embriológusok biztonságosan és hatékonyan elvégezhetik, az embrió károsodása miatti nyilvánvaló aggodalomra ad okot. Még ha a beültetés sikeres is, aggodalomra ad okot, hogy az embrió biopsziája ebben a szakaszban olyan szövődményekhez vezethet, mint a vetélés, vagy a méhlepény funkcióival kapcsolatos problémák a terhesség későbbi szakaszában. Továbbá, mivel a TE-nek a méhlepényhez kell differenciálódnia, nem pedig magához a magzathoz, vita van azzal kapcsolatban, hogy ezeknek a sejteknek a kromoszómaelemzése mindig reprezentálja-e a magzat kromoszóma-komplementját. Ezen okok miatt, és mivel a TE-biopszia munkaigényes és költséges, a PGT-A még mindig nem szorította ki a morfológiai értékelést az embriószelekció klinikai standardjaként.

Ideális lenne egy pontos, nem invazív módszer az embriók aneuploidiai szűrésére a beültetés előtt. Ennek érdekében a noninvazív PGT-A (NI-PGT-A) módszerek fejlesztése aktív kutatási terület. A megközelítés kihasználja a sejtmentes DNS (cfDNS) izolálását, amely a blasztocisztából kiválasztódik az elhasznált táptalajba (SCM). Az SCM-et rutinszerűen eldobják, miután az embriót eltávolították a tenyészetből, azonban az embrióból kis mennyiségű DNS izolálható, amplifikálható, majd szekvenálható a kromoszómális kópiaszám elemzéséhez. Nyilvánvaló előnye, hogy ez a folyamat az embrió károsodása nélkül is végbemehet. Ennek a nem invazív megközelítésnek egy további feltételezett előnye, hogy a DNS mind a TE-ből, mind a belső sejttömegből (ICM) szekretálódik, ami elméletileg a magzati kariotípus pontosabb reprezentációjaként szolgál, mint a pusztán a TE biopsziából izolált DNS.

Az NI-PGT-A telepítésének technikai korlátai az SCM-ben elérhető korlátozott mennyiségű DNS-hez kapcsolódnak. Ellentétben a genetikai tesztelés más módszereivel, ahol bőséges mennyiségű genetikai anyag könnyen kinyerhető vérből, magzatvízből vagy szövetbiopsziából, a blasztocisztákból származó sejtmentes DNS-szekréció rendkívül kicsi. A laboratóriumi protokollok azonban gyorsan fejlődnek, amit számos publikáció bizonyít, amelyek már igazolták a magas szintű konzisztenciát, amikor a kromoszómális kópiaszámot párhuzamosan NI-PGT-A és hagyományos PGT-A elemzi.

Míg ezek a tanulmányok a koncepció bizonyítását és a preklinikai validálást illusztrálták, a valódi diagnosztikai pontosság csak a negatív (euploid) és pozitív (aneuploid) eredmények prediktív értékének értékelésével értékelhető. Pontosabban, az euploidnak talált embrióknak nagyobb képességgel kell rendelkezniük az élve születésig tartó tartós beágyazódásra, míg az aneuploid embrióknak drámaian alacsonyabbnak kell lenniük a tartós beágyazódásnak, vagy előre jelezhetik a klinikai aneuploiditást. Szigorú klinikai validáció nélkül ezeknek az eredményeknek az embriószelekcióra való felhasználása téves diagnózishoz vezethet, ami egészségtelen embriók szelekcióját, vagy olyan embriók elleni szelekciót okozhat, amelyek potenciálisan életképesek lettek volna.

Annak meghatározására, hogy az NI-PGT-A klinikailag robusztus-e, egy nem szelekciós, kísérleti vizsgálatot javasolunk, amelyben az embriószelekciót rutin klinikai módszerekkel (azaz morfológiai szelekcióval) hajtják végre. Azonban a klinikai eredmény megnyilvánulása után az SCM-et a kereskedelemben kapható NI-PGT-A protokollok segítségével vak módszerrel elemzik. A klinikai eredmények és az NI-PGT-A eredmények korrelációjával a pozitív és negatív prediktív értékek torzítás nélkül számíthatók ki. Mivel nem hajtanak végre olyan beavatkozást, amely eltér a klinikai rutintól, nem jelent további kockázatot az embrióra vagy a szülőre nézve.

Ez a tanulmány kísérleti kísérletként szolgál egy lehetséges jövőbeli kísérlethez. Ha az NI-PGT-A ésszerű prediktív értéke bebizonyosodik, indokolt lehet egy prospektív, szelekciós vizsgálat az NI-PGT-A klinikai környezetben való hasznosságának vizsgálatára.

Kutatási terv:

A betegeket klinikai indikációnként IVF-ICSI-nek vetik alá, és a tervek szerint az összes embriót lefagyasztják a halasztott embriótranszfer érdekében. Az embriótenyésztés a rutin protokollokat követi, és az embriószelekciót az átvitelhez standard morfológiai kritériumok alapján végzik el. Az összes életképesnek tűnő blasztocisztából származó SCM-et összegyűjtik és egy referencialaboratóriumba szállítják (46. szekvencia). A mintákon teljesen mentesülnek a betegadatoktól, és egy hozzáférési számmal látják el őket. Az NI-PGT-A analízist egy kereskedelmi készlettel végzik el, a gyártó ajánlásainak megfelelően, a technikusok nem látják a klinikai eredményeket. Amikor a betegek visszatérnek az embriótranszfer ciklusba, a rutin klinikai protokollt követik az endometrium előkészítésére. Egyetlen embriót a rutin morfológiai osztályozási kritériumok szerint választanak ki, és az embrióátültetést szabványos technikákkal végzik. A terhesség kezdeti kimenetelét szérum hCG-teszttel dokumentálják. Ha a hCG-teszt pozitív, a korai terhességet klinikai rutinonként ultrahangvizsgálattal igazolják. Miután az összes beteg befejezte a kezelést, és a klinikai eredmények megnyilvánultak (sikertelen beültetés, vetélés vagy folyamatban lévő terhesség (13 héten túli életképességként definiálva), az NI-PGT-A eredményeket átadják a klinikai csapatnak, és a klinikai eredményekkel korrelálják a prediktív hatás kiszámításához. értékeket. Minden folyamatban lévő terhességnek rutin prenatális szűrést kínálnak a magzati aneuploidiák kimutatására.

A laboratóriumi protokollokkal kapcsolatos további részletek a következők:

Blastocysta tenyésztés Az embriótenyésztés a rutin protokollokat követi. A megtermékenyítés utáni 3. napon az embriókat ismételten pipettázzák egy sor tápközegcseppen keresztül, hogy csökkentsék az anyai sejtszennyeződés lehetőségét. Az embriókat ezután egyenként tenyésztik 35 µl embriótenyésztő tápközeg cseppekben a blasztociszta állapotig. Az 5. vagy a 6. napon a blasztociszták fejlődését és minőségét standard morfológiai kritériumok alapján értékeljük.

Mintagyűjtés és blasztociszta vitrifikáció A kiválasztott embriókból származó Blastocyst tenyésztőközeget (20 µL) összegyűjtjük, PCR-csövekbe visszük át, és -20 °C-on tároljuk a teljes genom-amplifikációig (WGA). A blasztocisztákat rutin vitrifikációs protokoll szerint lefagyasztják, és folyékony nitrogénben tárolják a rutin klinikai protokoll szerint. A referencialaboratóriumba való szállítás előtt a mintákat teljesen eltávolítják a betegadatokról, és egy hozzáférési számmal látják el őket (Sequence46).

A teljes genom amplifikációját és DNS szekvenálását az NI-PGT-A analízist kézhezvételkor, a gyártó ajánlásainak megfelelő kereskedelmi készlet felhasználásával végzik el, a klinikai eredményekre vak technikusok mellett. A DNS-t teljes genom-amplifikációval (WGA) amplifikálják, és vonalkóddal látják el a könyvtárak elkészítéséhez. A könyvtárakat ezután egy Ion Chef műszerbe töltik fel templát-előkészítéshez automatizált klonális amplifikációval, majd egy chipre töltik a DNS-szekvenáláshoz Ion Genestudio S5 Prime rendszeren, körülbelül 150 000-200 000 szekvenálási leolvasással mintánként. Az adatok elemzése az Ion Reporter szoftverrel (v5.10 vagy újabb) történik. A ploiditás mérése az alapvonal, az Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) alapvonal segítségével történik. A szabványos minőség-ellenőrzési intézkedéseket értékelni kell. Az eredményeket 6 héttel az embriótranszfer után adják át a klinikai csapatnak, és a prediktív értékek kiszámításához korrelálják a klinikai eredményekkel.

Betegpopuláció:

Bevételi kritériumok:

IVF-ICSI-n áteső beteg 21-35 éves a beiratkozáskor Elektív fagyasztási ciklus Egy embrió átültetésének tervezése

Kizárási kritériumok:

PGT-A, PGT-SR, PGT-M átesett. Ismétlődő terhességvesztés története Ismétlődő beültetési kudarc története Több mint 1 embrió átültetésének tervezése

A korosztály indokolása az aneuploidián kívüli életkorral összefüggő tényezők ellenőrzése, amelyek befolyásolhatják a beültetést, így minimálisra csökkentik azokat a változókat, amelyek komplikálhatják a prediktív értékszámításokat. A részvétel 35 év alatti betegekre való korlátozása az embriók kiválasztását is optimalizálja, így a morfológiailag normális embriók nagy valószínűséggel egészségesek. Ezenkívül az ebbe a korcsoportba tartozó betegeknél a legalacsonyabb a klinikai aneuploidiák, például a Down-szindróma kockázata.

Adatkezelés és tárolás:

A kutatási mintákat egyedi regisztrációs szám azonosítja, de a betegazonosító adatok nem. A mintákat a Sequence46 dolgozza fel, a hozzáférési számhoz társított eredményekkel. Az adatokat egy biztonságos felhőszolgáltatáson keresztül töltik fel, amelyhez az elsődleges nyomozó hozzáfér, hogy egyesüljön az elektronikus esetbejelentő űrlappal (eCRF), amelyet helyben az Olive Fertility Centerben tárolnak majd egy titkosított merevlemezen, amelyhez biztonsági másolatot készítenek. egy másodlagos helyi meghajtón. Az eCRF tartalmazza a betegek egyedi kórlapszámát és életkorát, de nem dokumentálja a nevet, születési dátumot vagy más azonosító információt. Az NI-PGT-A analízis eredményei és a klinikai eredmények szintén az eCRF-ben lesznek tárolva.

A kutatási adatokat a megjelenéstől számított 5 évig megőrizzük.

Statisztikai analízis:

A diagnosztikai pontosságot a pozitív és negatív prediktív értékek összefüggésében kell értelmezni.

Pozitív eredmény az aneuploiditásnak vagy mozaikizmusnak megfelelő megállapítás. A negatív eredmény az euploiditásnak megfelelő megállapítás.

PPV = (sikertelen beültetés + vetélés + klinikai aneuploidia)/ Minden pozitív eredmény NPV = folyamatban lévő terhesség / minden negatív eredmény

Mintaméret számítás:

Százhúsz (120) betegnek elegendőnek kell lennie ehhez a kísérleti vizsgálathoz. Korábbi kutatások kimutatták, hogy a 35 éves vagy annál fiatalabb betegeknél az euploid:aneuploid embriók aránya körülbelül 60:40. Az euploid embriók körülbelül 70%-a fog beágyazódni, és ezek 85%-ának továbbra is életképesnek kell lennie. Az aneuploid embriók körülbelül 25%-a fog beágyazódást okozni, és ezeknek >99%-a elvetél; a klinikai aneuploidia kockázata kevesebb, mint 0,5% a 35 éves és fiatalabb nőknél.

Tekintettel ezekre a valószínűségekre, a bevonandó 120 beteg közül 72 euploid embrió várható, amelyek közül 50-nek be kell ültetnie, és 43-nak továbbra is fennálló, életképes terhessége lesz. A várhatóan aneuploid 48-ból 12 fog beültetni, ezek közül mindegyiknek el kell vetélnie (a klinikai aneuploidia esélye ebben a populációban kevesebb, mint 0,5%).

Toborzás:

Azokat a betegeket, akik IVF-ICSI-t végeznek az Olive Fertility Centerben, és megfelelnek a befogadási/kizárási kritériumoknak, közvetlenül a társvizsgálók veszik fel. A szórólapokat a klinikán belül helyezzük el.