Prueba de detección cromosómica no invasiva para selección de embriones (NICEST)

Hipótesis:

El análisis del ADN libre de células (cfDNA) liberado de embriones en desarrollo en medios de cultivo gastados (SCM) puede servir como un método no invasivo para realizar pruebas genéticas previas a la implantación para aneuploidía (PGT-A). Un estudio de no selección que compare los resultados clínicos con los resultados NI-PGT-A de los embriones transferidos de manera ciega caracterizará la precisión del diagnóstico mediante la determinación de los valores predictivos positivos y negativos.

Justificación:

Durante el proceso de fecundación in vitro (FIV), la selección de un embrión sano está limitada por la incapacidad del aspecto microscópico para revelar el complemento cromosómico. Por lo tanto, con el fin de seleccionar de forma fiable embriones cromosómicamente normales, se realizan pruebas genéticas preimplantacionales para aneuploidías (PGT-A). PGT-A requiere una biopsia del embrión, la amplificación del ADN y luego la secuenciación de próxima generación (NGS) para determinar el número de copias cromosómicas.

Si bien se ha demostrado la utilidad clínica de PGT-A, el proceso tiene limitaciones, la más importante de las cuales es el requisito de la biopsia del embrión. Por lo general, se extraen de 5 a 10 células del TE después de que se haya roto la zona pelúcida. Si bien el procedimiento puede ser realizado de manera segura y efectiva por embriólogos capacitados, la preocupación obvia por el daño al embrión es relevante. Incluso si la implantación se lleva a cabo con éxito, se ha planteado la preocupación de que la biopsia del embrión en esta etapa pueda provocar complicaciones como un aborto espontáneo o problemas con la función de la placenta más adelante en el embarazo. Además, debido a que el TE está destinado a diferenciarse a placenta y no al propio feto, existe controversia sobre si el análisis cromosómico de estas células es siempre representativo del complemento cromosómico del feto. Por estas razones, y debido a que la biopsia TE es laboriosa y costosa, la PGT-A aún no ha suplantado a la evaluación morfológica como estándar clínico para la selección de embriones.

Lo ideal sería un método no invasivo preciso para la detección de aneuploidías en embriones antes de la implantación. Con este fin, el desarrollo de métodos no invasivos de PGT-A (NI-PGT-A) es un área de investigación activa. El enfoque aprovecha la capacidad de aislar el ADN libre de células (cfDNA) que se secreta del blastocisto en los medios de cultivo gastados (SCM). La SCM se desecha de forma rutinaria después de que el embrión se ha extraído del cultivo; sin embargo, se pueden aislar, amplificar y luego secuenciar cantidades diminutas de ADN del embrión para el análisis del número de copias cromosómicas. La ventaja obvia es que este proceso puede ocurrir sin causar ningún daño al embrión. Un beneficio putativo adicional de este enfoque no invasivo es que el ADN es secretado tanto por el TE como por la masa celular interna (ICM), lo que teóricamente sirve como una representación más precisa del cariotipo fetal que el ADN aislado solo de la biopsia del TE.

Las limitaciones técnicas de implementar NI-PGT-A están relacionadas con la cantidad limitada de ADN disponible en el SCM. A diferencia de otros modos de pruebas genéticas en los que se extrae fácilmente una gran cantidad de material genético de la sangre, el líquido amniótico o la biopsia de tejido, la secreción de ADN libre de células de los blastocistos es excepcionalmente pequeña en cantidad. Sin embargo, los protocolos de laboratorio se están desarrollando rápidamente, como lo demuestran numerosas publicaciones que ya han demostrado un alto nivel de consistencia cuando el NI-PGT-A y el PGT-A tradicional analizan el número de copias cromosómicas en paralelo.

Si bien estos estudios han ilustrado la prueba de concepto y la validación preclínica, la verdadera precisión diagnóstica solo puede evaluarse evaluando el valor predictivo de los resultados negativos (euploides) y positivos (aneuploides). Específicamente, los embriones que se encuentran euploides deberían tener una mayor capacidad para la implantación sostenida que procede al nacimiento vivo, mientras que los embriones aneuploides deberían tener una tasa de implantación sostenida mucho más baja, o serán predictivos de aneuploidía clínica. Sin una validación clínica rigurosa, el uso de estos resultados para la selección de embriones podría conducir a un diagnóstico erróneo, provocando la selección de embriones no saludables o la selección contra embriones que podrían haber sido potencialmente viables.

Para determinar si NI-PGT-A es clínicamente sólido, proponemos un estudio piloto, sin selección, mediante el cual la selección de embriones se realiza mediante métodos clínicos de rutina (es decir, selección morfológica). Sin embargo, después de que se haya manifestado el resultado clínico, el SCM se analizará mediante protocolos NI-PGT-A disponibles comercialmente de manera ciega. Al correlacionar los resultados clínicos con los resultados de NI-PGT-A, los valores predictivos positivos y negativos se pueden calcular sin sesgos. Debido a que no se realizará ninguna intervención que se desvíe de la rutina clínica, no se presentará ningún riesgo adicional para el embrión o los padres.

Este estudio servirá como piloto para posibles ensayos futuros. Si se demuestra un valor predictivo razonable de NI-PGT-A, podría justificarse un estudio de selección prospectivo para investigar la utilidad de NI-PGT-A en un entorno clínico.

Diseño de la investigación:

Los pacientes se someterán a FIV-ICSI por indicación clínica, con planes para congelar todos los embriones para transferencia diferida de embriones. El cultivo de embriones seguirá los protocolos de rutina y la selección de embriones para la transferencia se realizará utilizando criterios morfológicos estándar. Se recolectará SCM de todos los blastocistos que parezcan viables y se enviará a un laboratorio de referencia (Secuencia 46). Las muestras serán completamente desidentificadas de la información del paciente y etiquetadas con un número de acceso. El análisis NI-PGT-A se realizará utilizando un kit comercial de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, con técnicos cegados a los resultados clínicos. Cuando las pacientes regresen para el ciclo de transferencia de embriones, se seguirá el protocolo clínico de rutina para la preparación del endometrio. Se seleccionará un solo embrión de acuerdo con los criterios de clasificación morfológicos de rutina, y la transferencia de embriones se realizará con técnicas estándar. El resultado inicial del embarazo se documentará con pruebas de hCG en suero. Si la prueba de hCG es positiva, el embarazo temprano se confirmará con una evaluación de ultrasonido según la rutina clínica. Después de que todos los pacientes hayan completado el tratamiento y se hayan manifestado los resultados clínicos (implantación fallida, aborto espontáneo o embarazo en curso (definido como viabilidad más allá de las 13 semanas), los resultados del NI-PGT-A se comunicarán al equipo clínico y se correlacionarán con los resultados clínicos para el cálculo de la capacidad predictiva). valores. A todos los embarazos en curso se les ofrecerá un examen prenatal de rutina para detectar aneuploidías fetales.

Los detalles adicionales con respecto a los protocolos de laboratorio son los siguientes:

Cultivo de blastocistos El cultivo de embriones seguirá los protocolos de rutina. En el día 3 después de la fertilización, los embriones se pipetearán repetidamente a través de una serie de gotitas de medios de cultivo para reducir el potencial de contaminación de células maternas. A continuación, los embriones se cultivarán individualmente en gotitas de 35 µl de medio de cultivo de embriones hasta el estadio de blastocisto. El día 5 o el día 6, se evaluará el desarrollo y la calidad del blastocisto utilizando criterios morfológicos estándar.

Recolección de muestras y vitrificación de blastocistos El medio de cultivo de blastocistos (20 µL) de embriones seleccionados se recolectará y transferirá a tubos PCR y se almacenará a -20 °C hasta la amplificación del genoma completo (WGA). Los blastocistos se congelarán mediante el protocolo de vitrificación de rutina y se almacenarán en nitrógeno líquido según el protocolo clínico de rutina. Las muestras se desidentificarán por completo de la información del paciente y se etiquetarán con un número de acceso antes de enviarlas al laboratorio de referencia (Secuencia 46).

La amplificación del genoma completo y el análisis NI-PGT-A de secuenciación de ADN se realizarán en el momento de la recepción, utilizando un kit comercial de acuerdo con las recomendaciones del fabricante, sin que los técnicos conozcan los resultados clínicos. El ADN se amplificará mediante la amplificación del genoma completo (WGA) y se codificará con barras para preparar bibliotecas. Luego, las bibliotecas se cargan en un instrumento Ion Chef para la preparación de plantillas mediante amplificación clonal automatizada y luego se cargan en un chip para secuenciación de ADN en un sistema Ion Genestudio S5 Prime, con aproximadamente 150 000-200 000 lecturas de secuenciación por muestra. Los datos se analizan utilizando el software Ion Reporter (v5.10 o posterior). La ploidía se medirá utilizando el valor inicial, el valor inicial de Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M). Se evaluarán las medidas estándar de control de calidad. Los resultados se comunicarán al equipo clínico 6 semanas después de la transferencia del embrión y se correlacionarán con los resultados clínicos para el cálculo de los valores predictivos.

Poblacion de pacientes:

Criterios de inclusión:

Paciente sometida a FIV-ICSI 21 - 35 años en el momento de la inscripción Ciclo electivo de congelación Planificación para la transferencia de un solo embrión

Criterio de exclusión:

Sometidos a PGT-A, PGT-SR, PGT-M Historial de pérdida recurrente de embarazo Historial de falla recurrente de implantación Planificación de la transferencia de más de 1 embrión

La justificación de la categoría de edad es controlar los factores relacionados con la edad distintos de la aneuploidía que pueden influir en la implantación, de modo que se minimicen las variables que podrían complicar los cálculos del valor predictivo. Limitar la participación a pacientes menores de 35 años también optimiza la selección de embriones, de modo que los embriones morfológicamente normales son probablemente saludables. Además, los pacientes en esta categoría de edad tienen el menor riesgo de aneuploidías clínicas como el síndrome de Down.

Gestión y almacenamiento de datos:

Las muestras de investigación se identificarán con un número de acceso único, pero no con información de identificación del paciente. Las muestras serán procesadas por Sequence46 con resultados asociados con el número de acceso. Los datos se cargarán a través de un servicio seguro en la nube, al que accederá el investigador principal para fusionarlos con el formulario de informe de caso electrónico (eCRF) que se almacenará localmente en el Olive Fertility Center en un disco duro encriptado que estará respaldado. en una unidad local secundaria. El eCRF contendrá el número de registro médico y la edad únicos de los pacientes, pero no documentará el nombre, la fecha de nacimiento ni ninguna otra información de identificación. Los resultados del análisis NI-PGT-A y el resultado clínico también se almacenarán en el eCRF.

Los datos de la investigación se conservarán durante 5 años a partir de la fecha de publicación.

Análisis estadístico:

La precisión diagnóstica se interpretará en el contexto de valores predictivos positivos y negativos.

Un resultado positivo es un hallazgo compatible con aneuploidía o mosaicismo. Un resultado negativo es un hallazgo compatible con la euploidía.

VPP = (Implantación fallida + aborto espontáneo + aneuploidía clínica)/Todos los resultados positivos VPN = Embarazo en curso/Todos los resultados negativos

Cálculo del tamaño de la muestra:

Ciento veinte (120) pacientes deberían ser suficientes para este estudio piloto. Investigaciones anteriores han establecido que en pacientes de 35 años o menos, la proporción de embriones euploides:aneuploides es de aproximadamente 60:40. De los embriones euploides, aproximadamente el 70 % se implantarán, de los cuales, el 85 % debería continuar con la viabilidad. De los embriones aneuploides, aproximadamente el 25 % se implantarán, de los cuales >99 % abortarán; el riesgo de una aneuploidía clínica es inferior al 0,5 % en mujeres de 35 años o menos.

Dadas estas probabilidades, de las 120 pacientes a enrolar, se esperan 72 embriones euploides de los cuales 50 deberán implantarse y 43 continuarán como embarazos viables en curso. De los 48 que se espera que sean aneuploides, 12 se implantarán, de los cuales todos deberían abortar (la posibilidad de una aneuploidía clínica en esta población es inferior al 0,5%).

Reclutamiento:

Los co-investigadores reclutarán directamente a los pacientes que estén buscando FIV-ICSI en el Olive Fertility Center y cumplan con los criterios de inclusión/exclusión. Se colocarán volantes dentro de la clínica.