Nichtinvasives Chromosomenscreening für Embryonenauswahlversuch (NICEST)

Hypothese:

Die Analyse von zellfreier DNA (cfDNA), die aus sich entwickelnden Embryonen in verbrauchtes Kulturmedium (SCM) freigesetzt wird, kann als nicht-invasive Methode zur Durchführung genetischer Präimplantationstests auf Aneuploidie (PGT-A) dienen. Eine Nicht-Auswahlstudie, die klinische Ergebnisse mit den NI-PGT-A-Ergebnissen der transferierten Embryonen in einer verblindeten Weise vergleicht, wird die diagnostische Genauigkeit durch Bestimmung positiver und negativer prädiktiver Werte charakterisieren

Rechtfertigung:

Während des Prozesses der In-vitro-Fertilisation (IVF) ist die Auswahl eines gesunden Embryos durch die Unfähigkeit des mikroskopischen Erscheinungsbildes begrenzt, die chromosomale Ergänzung zu erkennen. Daher wird zur zuverlässigen Auswahl chromosomal normaler Embryonen ein Präimplantationsgentest auf Aneuploidie (PGT-A) durchgeführt. PGT-A erfordert eine Biopsie des Embryos, eine Amplifikation der DNA und dann eine Sequenzierung der nächsten Generation (NGS), um die Anzahl der Chromosomenkopien zu bestimmen.

Während der klinische Nutzen von PGT-A nachgewiesen wurde, weist das Verfahren Einschränkungen auf, von denen die bedeutendste die Notwendigkeit einer Embryobiopsie ist. Typischerweise werden 5–10 Zellen aus der TE entfernt, nachdem die Zona pellucida durchbrochen wurde. Während das Verfahren von ausgebildeten Embryologen sicher und effektiv durchgeführt werden kann, ist die offensichtliche Sorge um eine Schädigung des Embryos relevant. Selbst wenn die Implantation erfolgreich verläuft, wurde die Sorge geäußert, dass die Biopsie des Embryos in diesem Stadium zu Komplikationen wie Fehlgeburten oder Problemen mit der Plazentafunktion später in der Schwangerschaft führen kann. Da die TE dazu bestimmt ist, sich eher zur Plazenta als zum Fötus selbst zu differenzieren, gibt es außerdem Kontroversen darüber, ob die Chromosomenanalyse dieser Zellen immer repräsentativ für das chromosomale Komplement des Fötus ist. Aus diesen Gründen und weil die TE-Biopsie mühsam und teuer ist, hat die PGT-A die morphologische Bewertung als klinischer Standard für die Embryoselektion immer noch nicht verdrängt.

Ideal wäre eine genaue nicht-invasive Methode für das Aneuploidie-Screening von Embryonen vor der Implantation. Zu diesem Zweck ist die Entwicklung nichtinvasiver PGT-A (NI-PGT-A)-Methoden ein Bereich aktiver Untersuchungen. Der Ansatz nutzt die Fähigkeit, zellfreie DNA (cfDNA), die von der Blastozyste in das verbrauchte Kulturmedium (SCM) abgesondert wird, zu isolieren. SCM wird routinemäßig verworfen, nachdem der Embryo aus der Kultur entfernt wurde, jedoch können winzige DNA-Mengen aus dem Embryo isoliert, amplifiziert und dann für die Analyse der chromosomalen Kopienzahl sequenziert werden. Der offensichtliche Vorteil besteht darin, dass dieser Vorgang ablaufen kann, ohne den Embryo zu schädigen. Ein zusätzlicher mutmaßlicher Vorteil dieses nicht-invasiven Ansatzes besteht darin, dass die DNA sowohl aus der TE als auch aus der inneren Zellmasse (ICM) sekretiert wird und theoretisch als genauere Darstellung des fötalen Karyotyps dient als die DNA, die nur aus der TE-Biopsie allein isoliert wurde.

Technische Einschränkungen beim Einsatz von NI-PGT-A hängen mit der begrenzten DNA-Menge zusammen, die im SCM verfügbar ist. Im Gegensatz zu anderen Arten von Gentests, bei denen große Mengen an genetischem Material leicht aus Blut, Fruchtwasser oder Gewebebiopsie extrahiert werden, ist die zellfreie DNA-Sekretion aus Blastozysten von außergewöhnlich geringer Menge. Laborprotokolle entwickeln sich jedoch schnell, was durch zahlreiche Veröffentlichungen belegt wird, die bereits ein hohes Maß an Konsistenz gezeigt haben, wenn die chromosomale Kopienzahl parallel mit NI-PGT-A und herkömmlicher PGT-A analysiert wird.

Während diese Studien den Machbarkeitsnachweis und die präklinische Validierung veranschaulicht haben, kann die wahre diagnostische Genauigkeit nur durch die Bewertung des Vorhersagewerts negativer (euploider) und positiver (aeneuploider) Ergebnisse beurteilt werden. Insbesondere sollten als euploid befundene Embryonen eine größere Fähigkeit zur anhaltenden Implantation haben, die zu einer Lebendgeburt führt, während aneuploide Embryonen eine dramatisch niedrigere Rate an anhaltender Implantation aufweisen sollten oder eine klinische Aneuploidie vorhersagen. Ohne rigorose klinische Validierung könnte die Verwendung dieser Ergebnisse für die Embryoselektion zu Fehldiagnosen führen, die eine Selektion von ungesunden Embryonen oder eine Selektion gegen Embryonen verursachen, die potenziell lebensfähig gewesen sein könnten.

Um zu bestimmen, ob NI-PGT-A klinisch robust ist, schlagen wir eine Pilotstudie ohne Selektion vor, bei der die Embryoselektion durch routinemäßige klinische Methoden (dh morphologische Selektion) durchgeführt wird. Nachdem sich jedoch das klinische Ergebnis manifestiert hat, wird die SCM durch ein kommerziell erhältliches NI-PGT-A-Protokoll in verblindeter Weise analysiert. Durch die Korrelation klinischer Ergebnisse mit NI-PGT-A-Ergebnissen können positive und negative Vorhersagewerte ohne Verzerrung berechnet werden. Da keine von der klinischen Routine abweichenden Eingriffe durchgeführt werden, entsteht kein zusätzliches Risiko für den Embryo oder die Eltern.

Diese Studie wird als Pilotprojekt für mögliche zukünftige Versuche dienen. Wenn ein angemessener Vorhersagewert von NI-PGT-A nachgewiesen wird, könnte eine prospektive Auswahlstudie gerechtfertigt sein, um den Nutzen von NI-PGT-A in einem klinischen Umfeld zu untersuchen.

Forschungsdesign:

Die Patienten werden je nach klinischer Indikation einer IVF-ICSI unterzogen, wobei geplant ist, alle Embryonen für einen verzögerten Embryotransfer einzufrieren. Die Embryonenkultur folgt Routineprotokollen und die Embryonenauswahl für den Transfer wird nach morphologischen Standardkriterien durchgeführt. SCM von allen lebensfähigen Blastozysten wird gesammelt und an ein Referenzlabor versandt (Sequenz 46). Proben werden vollständig von Patienteninformationen anonymisiert und mit einer Zugangsnummer gekennzeichnet. Die NI-PGT-A-Analyse wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wobei die Techniker gegenüber den klinischen Ergebnissen blind sind. Wenn die Patientinnen für den Embryotransferzyklus zurückkehren, wird das routinemäßige klinische Protokoll für die Vorbereitung des Endometriums befolgt. Ein einzelner Embryo wird nach routinemäßigen morphologischen Einstufungskriterien ausgewählt und der Embryotransfer wird mit Standardtechniken durchgeführt. Das Ergebnis der anfänglichen Schwangerschaft wird mit Serum-hCG-Tests dokumentiert. Wenn der hCG-Test positiv ist, wird eine frühe Schwangerschaft durch eine Ultraschalluntersuchung gemäß klinischer Routine bestätigt. Nachdem alle Patientinnen die Behandlung abgeschlossen haben und sich klinische Ergebnisse manifestiert haben (fehlgeschlagene Implantation, Fehlgeburt oder anhaltende Schwangerschaft (definiert als Lebensfähigkeit über 13 Wochen hinaus), werden die NI-PGT-A-Ergebnisse an das klinische Team weitergegeben und mit den klinischen Ergebnissen zur Berechnung der Vorhersage korreliert Werte. Allen laufenden Schwangerschaften wird ein routinemäßiges pränatales Screening auf fetale Aneuploidien angeboten.

Weitere Details zu Laborprotokollen sind wie folgt:

Blastozystenkultur Die Embryokultur folgt Routineprotokollen. Am Tag 3 nach der Befruchtung werden die Embryonen wiederholt durch eine Reihe von Kulturmedientröpfchen pipettiert, um das Potenzial für eine Kontamination mit mütterlichen Zellen zu verringern. Die Embryonen werden dann einzeln in 35-µl-Tröpfchen Embryokulturmedium bis zum Blastozystenstadium kultiviert. An Tag 5 oder Tag 6 werden Blastozystenentwicklung und -qualität unter Verwendung von morphologischen Standardkriterien bewertet.

Probenentnahme und Blastozysten-Vitrifikation Blastozysten-Kulturmedium (20 µl) von ausgewählten Embryonen wird gesammelt und in PCR-Röhrchen überführt und bei -20 °C bis zur Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) gelagert. Blastozysten werden gemäß dem routinemäßigen Vitrifikationsprotokoll eingefroren und gemäß dem klinischen Routineprotokoll in flüssigem Stickstoff gelagert. Proben werden vor dem Versand an das Referenzlabor (Sequence46) vollständig von Patienteninformationen anonymisiert und mit einer Zugangsnummer gekennzeichnet.

Amplifikation des gesamten Genoms und DNA-Sequenzierung Die NI-PGT-A-Analyse wird nach Erhalt unter Verwendung eines kommerziellen Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wobei die Techniker gegenüber den klinischen Ergebnissen blind sind. Die DNA wird durch Whole Genome Amplification (WGA) amplifiziert und mit einem Barcode versehen, um Bibliotheken vorzubereiten. Die Bibliotheken werden dann zur Template-Vorbereitung durch automatisierte klonale Amplifikation auf ein Ion Chef-Gerät geladen und dann auf einen Chip zur DNA-Sequenzierung auf einem Ion Genestudio S5 Prime-System geladen, mit ungefähr 150.000–200.000 Sequenzierungs-Reads pro Probe. Die Daten werden mit der Ion Reporter-Software (v5.10 oder höher) analysiert. Die Ploidie wird anhand der Basislinie Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline gemessen. Standardmaßnahmen zur Qualitätskontrolle werden evaluiert. Die Ergebnisse werden dem klinischen Team 6 Wochen nach dem Embryotransfer mitgeteilt und mit den klinischen Ergebnissen zur Berechnung der Vorhersagewerte korreliert.

Patientenpopulation:

Einschlusskriterien:

Patientin, die sich einer IVF-ICSI unterzieht 21 - 35 Jahre alt zum Zeitpunkt der Einschreibung Wahlweiser Freeze-All-Zyklus Planung für Einzelembryotransfer

Ausschlusskriterien:

In PGT-A, PGT-SR, PGT-M Vorgeschichte wiederholter Schwangerschaftsverluste Vorgeschichte wiederholter Implantationsfehler Planung des Transfers von mehr als 1 Embryo

Die Rechtfertigung für die Alterskategorie besteht darin, andere altersbezogene Faktoren als Aneuploidie zu kontrollieren, die die Implantation beeinflussen können, sodass Variablen, die die Vorhersagewertberechnungen beeinträchtigen könnten, minimiert werden. Die Beschränkung der Teilnahme auf Patienten unter 35 Jahren optimiert auch die Embryonenauswahl, sodass morphologisch normale Embryonen höchstwahrscheinlich gesund sind. Darüber hinaus haben Patienten dieser Altersgruppe das geringste Risiko für klinische Aneuploidien wie das Down-Syndrom.

Datenverwaltung und -speicherung:

Forschungsproben werden durch eine eindeutige Zugangsnummer, aber keine Patientenidentifizierungsinformationen identifiziert. Die Proben werden von Sequence46 verarbeitet, wobei die Ergebnisse der Zugangsnummer zugeordnet werden. Die Daten werden über einen sicheren Cloud-Dienst hochgeladen, auf den der Hauptforscher zugreift, um ihn mit dem elektronischen Fallberichtsformular (eCRF) zusammenzuführen, das lokal im Olive Fertility Center auf einer verschlüsselten Festplatte gespeichert wird, die gesichert wird. auf einem sekundären lokalen Laufwerk. Das eCRF enthält die eindeutige Krankenaktennummer und das Alter des Patienten, dokumentiert jedoch nicht den Namen, das Geburtsdatum oder andere identifizierende Informationen. Die Ergebnisse der NI-PGT-A-Analyse und das klinische Ergebnis werden ebenfalls im eCRF gespeichert.

Forschungsdaten werden für 5 Jahre nach dem Datum der Veröffentlichung aufbewahrt.

Statistische Analyse:

Die diagnostische Genauigkeit wird im Zusammenhang mit positiven und negativen prädiktiven Werten interpretiert.

Ein positives Ergebnis ist ein Befund, der mit Aneuploidie oder Mosaizismus vereinbar ist. Ein negatives Ergebnis ist ein Befund, der mit Euploidie vereinbar ist.

PPV = (fehlgeschlagene Implantation + Fehlgeburt + klinische Aneuploidie)/ Alle positiven Ergebnisse NPV = Andauernde Schwangerschaft / Alle negativen Ergebnisse

Berechnung der Stichprobengröße:

Einhundertzwanzig (120) Patienten sollten für diese Pilotstudie ausreichen. Frühere Untersuchungen haben ergeben, dass bei Patienten im Alter von 35 Jahren oder jünger das Verhältnis von euploiden zu aneuploiden Embryonen etwa 60:40 beträgt. Von den euploiden Embryonen werden sich etwa 70 % einnisten, von denen 85 % lebensfähig bleiben sollten. Von den aneuploiden Embryonen werden sich etwa 25 % einnisten, von denen > 99 % eine Fehlgeburt erleiden; Das Risiko einer klinischen Aneuploidie liegt bei Frauen unter 35 Jahren unter 0,5 %.

Angesichts dieser Wahrscheinlichkeiten werden von den 120 einzuschreibenden Patientinnen 72 euploide Embryonen erwartet, von denen 50 implantiert werden sollten und 43 als andauernde, lebensfähige Schwangerschaften fortgesetzt werden. Von den 48, von denen erwartet wird, dass sie aneuploid sind, werden 12 implantiert, von denen alle eine Fehlgeburt haben sollten (die Wahrscheinlichkeit einer klinischen Aneuploidie in dieser Population beträgt weniger als 0,5 %).

Rekrutierung:

Patienten, die IVF-ICSI im Olive Fertility Center durchführen und die Einschluss-/Ausschlusskriterien erfüllen, werden direkt von den Co-Ermittlern rekrutiert. Flyer werden in der Klinik ausgehängt.