Screening cromosomico non invasivo per la prova di selezione degli embrioni (NICEST)

Ipotesi:

L'analisi del DNA libero cellulare (cfDNA) rilasciato dagli embrioni in via di sviluppo nei terreni di coltura esauriti (SCM) può servire come metodo non invasivo per l'esecuzione di test genetici preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A). Uno studio non selettivo che confronta i risultati clinici con i risultati NI-PGT-A degli embrioni trasferiti in cieco caratterizzerà l'accuratezza diagnostica mediante la determinazione dei valori predittivi positivi e negativi

Giustificazione:

Durante il processo di fecondazione in vitro (IVF), la selezione di un embrione sano è limitata dall'incapacità dell'aspetto microscopico di rivelare il corredo cromosomico. Pertanto, al fine di selezionare in modo affidabile embrioni cromosomicamente normali, viene eseguito il test genetico preimpianto per l'aneuploidia (PGT-A). PGT-A richiede la biopsia dell'embrione, l'amplificazione del DNA, quindi il sequenziamento di nuova generazione (NGS) per determinare il numero di copie del cromosoma.

Mentre l'utilità clinica di PGT-A è stata dimostrata, il processo ha dei limiti, il più significativo dei quali è il requisito per la biopsia embrionale. Tipicamente, 5-10 cellule vengono rimosse dal TE dopo che la zona pellucida è stata violata. Sebbene la procedura possa essere eseguita in modo sicuro ed efficace da embriologi qualificati, l'ovvia preoccupazione per il danno all'embrione è rilevante. Anche se l'impianto avviene con successo, è stata sollevata la preoccupazione che la biopsia dell'embrione in questa fase possa portare a complicazioni come aborto spontaneo o problemi con la funzione placentare più avanti nella gravidanza. Inoltre, poiché il TE è destinato a differenziarsi alla placenta piuttosto che al feto stesso, c'è controversia sul fatto che l'analisi cromosomica di queste cellule sia sempre rappresentativa del corredo cromosomico del feto. Per questi motivi, e poiché la biopsia TE è laboriosa e costosa, la PGT-A non ha ancora soppiantato la valutazione morfologica come standard clinico per la selezione degli embrioni.

Un accurato metodo non invasivo per lo screening dell'aneuploidia degli embrioni prima dell'impianto sarebbe l'ideale. A tal fine, lo sviluppo di metodi PGT-A non invasivi (NI-PGT-A) è un'area di indagine attiva. L'approccio sfrutta la capacità di isolare il DNA privo di cellule (cfDNA) che viene secreto dalla blastocisti nel mezzo di coltura esaurito (SCM). SCM viene regolarmente scartato dopo che l'embrione è stato rimosso dalla coltura, tuttavia, piccole quantità di DNA dall'embrione possono essere isolate, amplificate, quindi sequenziate per l'analisi del numero di copie cromosomiche. L'ovvio vantaggio è che questo processo può avvenire senza causare alcun danno all'embrione. Un ulteriore presunto vantaggio di questo approccio non invasivo è che il DNA viene secreto sia dal TE che dalla massa cellulare interna (ICM), servendo teoricamente come rappresentazione più accurata del cariotipo fetale rispetto al DNA isolato dalla sola biopsia TE.

I limiti tecnici della distribuzione di NI-PGT-A sono legati alla quantità limitata di DNA disponibile nell'SCM. A differenza di altre modalità di test genetico in cui ampie quantità di materiale genetico vengono prontamente estratte dal sangue, dal liquido amniotico o dalla biopsia tissutale, la secrezione di DNA libero dalle blastocisti è eccezionalmente ridotta. Tuttavia, i protocolli di laboratorio si stanno sviluppando rapidamente, evidenziato da numerose pubblicazioni che hanno già dimostrato un alto livello di coerenza quando il numero di copie cromosomiche viene analizzato da NI-PGT-A e PGT-A tradizionale in parallelo.

Sebbene questi studi abbiano illustrato la prova del concetto e la convalida preclinica, la vera accuratezza diagnostica può essere valutata solo valutando il valore predittivo dei risultati negativi (euploidi) e positivi (aneuploidi). In particolare, gli embrioni risultati essere euploidi dovrebbero avere una maggiore capacità di impianto sostenuto che procede alla nascita viva, mentre gli embrioni aneuploidi dovrebbero avere un tasso notevolmente inferiore di impianto sostenuto, o saranno predittivi di aneuploidia clinica. Senza una rigorosa convalida clinica, l'utilizzo di questi risultati per la selezione degli embrioni potrebbe portare a diagnosi errate, causando la selezione di embrioni malsani o la selezione contro embrioni che avrebbero potuto essere potenzialmente vitali.

Per determinare se NI-PGT-A è clinicamente robusto, proponiamo uno studio pilota di non selezione, in cui la selezione degli embrioni viene eseguita con metodi clinici di routine (ad esempio, selezione morfologica). Tuttavia, dopo che l'esito clinico si è manifestato, l'SCM sarà analizzato da un protocollo NI-PGT-A disponibile in commercio in cieco. Correlando i risultati clinici ai risultati NI-PGT-A, i valori predittivi positivi e negativi possono essere calcolati senza bias. Poiché non verrà eseguito alcun intervento che si discosti dalla routine clinica, non verrà posto alcun rischio aggiuntivo per l'embrione o il genitore.

Questo studio servirà da pilota per una possibile sperimentazione futura. Se viene dimostrato un ragionevole valore predittivo di NI-PGT-A, potrebbe essere giustificato uno studio prospettico di selezione per indagare l'utilità di NI-PGT-A in ambito clinico.

Progetto di ricerca:

I pazienti saranno sottoposti a fecondazione in vitro-ICSI per indicazione clinica, con piani per congelare tutti gli embrioni per il trasferimento embrionale differito. La coltura degli embrioni seguirà i protocolli di routine e la selezione degli embrioni per il trasferimento sarà eseguita utilizzando criteri morfologici standard. Gli SCM di tutte le blastocisti che sembrano vitali saranno raccolti e spediti a un laboratorio di riferimento (sequenza 46). I campioni saranno completamente anonimi delle informazioni del paziente ed etichettati con un numero di accesso. L'analisi NI-PGT-A verrà eseguita utilizzando un kit commerciale secondo le raccomandazioni del produttore, con i tecnici all'oscuro dei risultati clinici. Quando i pazienti torneranno per il ciclo di trasferimento dell'embrione, verrà seguito il protocollo clinico di routine per la preparazione dell'endometrio. Un singolo embrione sarà selezionato secondo i criteri di classificazione morfologica di routine e il trasferimento dell'embrione sarà eseguito con tecniche standard. L'esito iniziale della gravidanza sarà documentato con test hCG sierico. Se il test hCG è positivo, la gravidanza precoce sarà confermata con valutazione ecografica secondo la routine clinica. Dopo che tutti i pazienti hanno completato il trattamento e si sono manifestati gli esiti clinici (impianto fallito, aborto spontaneo o gravidanza in corso (definita come vitalità oltre le 13 settimane), i risultati NI-PGT-A verranno rilasciati al team clinico e correlati agli esiti clinici per il calcolo del valore predittivo valori. A tutte le gravidanze in corso verrà offerto uno screening prenatale di routine per le aneuploidie fetali.

Ulteriori dettagli sui protocolli di laboratorio sono i seguenti:

Coltura di blastocisti La coltura di embrioni seguirà i protocolli di routine. Il giorno 3 post-fecondazione, gli embrioni saranno ripetutamente pipettati attraverso una serie di goccioline di terreni di coltura per ridurre il potenziale di contaminazione delle cellule materne. Gli embrioni verranno quindi coltivati ​​individualmente in goccioline da 35µL di mezzo di coltura embrionale fino allo stadio di blastocisti. Il giorno 5 o 6, lo sviluppo e la qualità della blastocisti saranno valutati utilizzando criteri morfologici standard.

Raccolta dei campioni e vitrificazione della blastocisti Il terreno di coltura della blastocisti (20µL) da embrioni selezionati sarà raccolto e trasferito in provette per PCR e conservato a -20°C fino all'amplificazione dell'intero genoma (WGA). Le blastocisti saranno congelate tramite il protocollo di vetrificazione di routine e conservate in azoto liquido secondo il protocollo clinico di routine. I campioni saranno completamente anonimi delle informazioni del paziente ed etichettati con un numero di accesso prima della spedizione al laboratorio di riferimento (sequenza46).

L'amplificazione dell'intero genoma e il sequenziamento del DNA L'analisi NI-PGT-A verrà eseguita al ricevimento, utilizzando un kit commerciale secondo le raccomandazioni del produttore, con i tecnici all'oscuro dei risultati clinici. Il DNA sarà amplificato mediante amplificazione dell'intero genoma (WGA) e codificato a barre per preparare le librerie. Le librerie vengono quindi caricate su uno strumento Ion Chef per la preparazione del templato mediante amplificazione clonale automatizzata e quindi caricate su un chip per il sequenziamento del DNA su un sistema Ion Genestudio S5 Prime, con circa 150.000-200.000 letture di sequenziamento per campione. I dati vengono analizzati utilizzando il software Ion Reporter (v5.10 o successiva). La ploidia sarà misurata utilizzando il basale, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) Baseline. Saranno valutate le misure standard di controllo della qualità. I risultati saranno rilasciati al team clinico 6 settimane dopo il trasferimento dell'embrione e correlati agli esiti clinici per il calcolo dei valori predittivi.

Popolazione di pazienti:

Criterio di inclusione:

Paziente sottoposto a fecondazione in vitro-ICSI 21 - 35 anni al momento dell'arruolamento Ciclo elettivo di congelamento totale Pianificazione del trasferimento di un singolo embrione

Criteri di esclusione:

Sottoposto a PGT-A, PGT-SR, PGT-M Storia di aborti ricorrenti Storia di fallimenti di impianto ricorrenti Pianificazione del trasferimento di più di 1 embrione

La giustificazione per la categoria di età è controllare i fattori legati all'età diversi dall'aneuploidia che possono influenzare l'impianto, quindi le variabili che potrebbero comporre i calcoli del valore predittivo sono ridotte al minimo. Limitare la partecipazione ai pazienti sotto i 35 anni ottimizza anche la selezione degli embrioni in modo tale che gli embrioni morfologicamente normali siano molto probabilmente sani. Inoltre, i pazienti in questa fascia di età hanno il minor rischio di aneuploidie cliniche come la sindrome di Down.

Gestione e archiviazione dei dati:

I campioni di ricerca saranno identificati da un numero di accesso univoco, ma nessuna informazione di identificazione del paziente. I campioni verranno elaborati da Sequence46 con i risultati associati al numero di accesso. I dati verranno caricati tramite un servizio cloud sicuro, a cui l'investigatore principale accederà per fondersi con il modulo di segnalazione del caso elettronico (eCRF) che verrà archiviato localmente presso l'Olive Fertility Center su un disco rigido crittografato che verrà supportato- su un'unità locale secondaria. La eCRF conterrà il numero di cartella clinica e l'età univoci dei pazienti, ma non documenterà il nome, la data di nascita o qualsiasi altra informazione identificativa. Anche i risultati dell'analisi NI-PGT-A e l'esito clinico saranno archiviati nella eCRF.

I dati della ricerca saranno conservati per 5 anni dalla data di pubblicazione.

Analisi statistica:

L'accuratezza diagnostica sarà interpretata nel contesto di valori predittivi positivi e negativi.

Un risultato positivo è un reperto compatibile con aneuploidia o mosaicismo. Un risultato negativo è un risultato coerente con l'euploidia.

PPV = (impianto fallito + aborto spontaneo + aneuploidia clinica)/ tutti i risultati positivi NPV = gravidanza in corso / tutti i risultati negativi

Calcolo della dimensione del campione:

Centoventi (120) pazienti dovrebbero essere sufficienti per questo studio pilota. Precedenti ricerche hanno stabilito che nei pazienti di età pari o inferiore a 35 anni, il rapporto tra embrioni euploidi:aneuploidi è di circa 60:40. Degli embrioni euploidi, circa il 70% si impianterà, di cui l'85% dovrebbe continuare a essere vitale. Degli embrioni aneuploidi, circa il 25% si impianterà, di cui >99% abortirà; il rischio di aneuploidia clinica è inferiore allo 0,5% nelle donne di età pari o inferiore a 35 anni.

Date queste probabilità, dei 120 pazienti da arruolare, sono attesi 72 embrioni euploidi di cui 50 dovrebbero impiantarsi e 43 continueranno come gravidanze in corso e vitali. Dei 48 che dovrebbero essere aneuploidi, 12 si impiantano, di cui tutti dovrebbero abortire (la possibilità di un'aneuploidia clinica in questa popolazione è inferiore allo 0,5%).

Reclutamento:

I pazienti che stanno perseguendo IVF-ICSI presso l'Olive Fertility Center e soddisfano i criteri di inclusione/esclusione saranno reclutati direttamente dai co-ricercatori. I volantini saranno affissi all'interno della clinica.