Dépistage chromosomique non invasif pour l'essai de sélection d'embryons (NICEST)

Hypothèse:

L'analyse de l'ADN sans cellule (cfDNA) libéré des embryons en développement dans des milieux de culture épuisés (SCM) peut servir de méthode non invasive pour effectuer des tests génétiques préimplantatoires pour l'aneuploïdie (PGT-A). Une étude de non-sélection qui compare les résultats cliniques aux résultats NI-PGT-A des embryons transférés en aveugle caractérisera la précision du diagnostic en déterminant des valeurs prédictives positives et négatives

Justification:

Au cours du processus de fécondation in vitro (FIV), la sélection d'un embryon sain est limitée par l'incapacité de l'aspect microscopique à révéler le complément chromosomique. Ainsi, afin de sélectionner de manière fiable des embryons chromosomiquement normaux, un test génétique préimplantatoire pour l'aneuploïdie (PGT-A) est effectué. Le PGT-A nécessite une biopsie de l'embryon, une amplification de l'ADN, puis un séquençage de nouvelle génération (NGS) pour déterminer le nombre de copies du chromosome.

Bien que l'utilité clinique du PGT-A ait été démontrée, le processus a des limites, dont la plus importante est l'exigence d'une biopsie embryonnaire. En règle générale, 5 à 10 cellules sont retirées du TE après la rupture de la zone pellucide. Bien que la procédure puisse être effectuée en toute sécurité et efficacement par des embryologistes formés, la préoccupation évidente concernant les dommages à l'embryon est pertinente. Même si l'implantation réussit, on craint que la biopsie de l'embryon à ce stade puisse entraîner des complications telles qu'une fausse couche ou des problèmes de fonction placentaire plus tard au cours de la grossesse. De plus, comme le TE est destiné à se différencier en placenta plutôt qu'en fœtus lui-même, il existe une controverse quant à savoir si l'analyse chromosomique de ces cellules est toujours représentative du complément chromosomique du fœtus. Pour ces raisons, et parce que la biopsie TE est laborieuse et coûteuse, la PGT-A n'a toujours pas supplanté l'évaluation morphologique comme norme clinique pour la sélection des embryons.

Une méthode non invasive précise pour le dépistage de l'aneuploïdie des embryons avant l'implantation serait idéale. À cette fin, le développement de méthodes PGT-A non invasives (NI-PGT-A) est un domaine d'investigation actif. L'approche exploite la capacité d'isoler l'ADN acellulaire (cfDNA) qui est sécrété par le blastocyste dans le milieu de culture usé (SCM). Le SCM est systématiquement jeté après que l'embryon a été retiré de la culture, cependant, des quantités infimes d'ADN de l'embryon peuvent être isolées, amplifiées, puis séquencées pour l'analyse du nombre de copies chromosomiques. L'avantage évident est que ce processus peut se produire sans nuire à l'embryon. Un avantage putatif supplémentaire de cette approche non invasive est que l'ADN est sécrété à la fois par le TE et la masse cellulaire interne (ICM), servant théoriquement de représentation plus précise du caryotype fœtal que l'ADN isolé à partir de la seule biopsie TE.

Les limitations techniques du déploiement de NI-PGT-A sont liées à la quantité limitée d'ADN disponible dans le SCM. Contrairement à d'autres modes de tests génétiques où de grandes quantités de matériel génétique sont facilement extraites du sang, du liquide amniotique ou de la biopsie tissulaire, la sécrétion d'ADN acellulaire des blastocystes est exceptionnellement infime. Cependant, les protocoles de laboratoire se développent rapidement, en témoignent de nombreuses publications qui ont déjà démontré un haut niveau de cohérence lorsque le nombre de copies chromosomiques est analysé par NI-PGT-A et PGT-A traditionnel en parallèle.

Bien que ces études aient illustré la preuve de concept et la validation préclinique, la véritable précision diagnostique ne peut être évaluée qu'en évaluant la valeur prédictive des résultats négatifs (euploïdes) et positifs (aneuploïdes). Plus précisément, les embryons trouvés euploïdes devraient avoir une plus grande capacité d'implantation soutenue qui aboutit à une naissance vivante, tandis que les embryons aneuploïdes devraient avoir un taux d'implantation soutenue considérablement plus faible, ou seront prédictifs de l'aneuploïdie clinique. Sans validation clinique rigoureuse, l'utilisation de ces résultats pour la sélection d'embryons pourrait conduire à un diagnostic erroné, entraînant la sélection d'embryons malsains ou la sélection contre des embryons qui auraient pu être potentiellement viables.

Pour déterminer si NI-PGT-A est cliniquement robuste, nous proposons une étude pilote de non-sélection, dans laquelle la sélection d'embryons est effectuée par des méthodes cliniques de routine (c'est-à-dire la sélection morphologique). Cependant, une fois le résultat clinique manifesté, le SCM sera analysé par un protocole NI-PGT-A disponible dans le commerce en aveugle. En corrélant les résultats cliniques aux résultats du NI-PGT-A, les valeurs prédictives positives et négatives peuvent être calculées sans biais. Étant donné qu'aucune intervention ne sera effectuée qui s'écarte de la routine clinique, aucun risque supplémentaire ne sera posé pour l'embryon ou le parent.

Cette étude servira de pilote pour un éventuel futur essai. Si une valeur prédictive raisonnable du NI-PGT-A est démontrée, une étude prospective de sélection pourrait être justifiée pour étudier l'utilité du NI-PGT-A dans un contexte clinique.

Conception de la recherche:

Les patients subiront une FIV-ICSI par indication clinique, avec des plans pour congeler tous les embryons pour un transfert d'embryon différé. La culture d'embryons suivra des protocoles de routine et la sélection d'embryons pour le transfert sera effectuée en utilisant des critères morphologiques standard. Le SCM de tous les blastocystes qui semblent viables sera collecté et expédié à un laboratoire de référence (séquence 46). Les échantillons seront complètement anonymisés des informations du patient et étiquetés avec un numéro d'accès. L'analyse NI-PGT-A sera effectuée à l'aide d'un kit commercial conformément aux recommandations du fabricant, avec des techniciens ignorant les résultats cliniques. Lorsque les patientes reviennent pour le cycle de transfert d'embryons, le protocole clinique de routine sera suivi pour la préparation de l'endomètre. Un seul embryon sera sélectionné selon des critères de classement morphologiques de routine, et le transfert d'embryons sera effectué avec des techniques standard. L'issue initiale de la grossesse sera documentée par des tests sériques d'hCG. Si le test hCG est positif, le début de la grossesse sera confirmé par une évaluation échographique selon la routine clinique. Une fois que tous les patients ont terminé le traitement et que les résultats cliniques se sont manifestés (échec d'implantation, fausse couche ou grossesse en cours (définie comme la viabilité au-delà de 13 semaines), les résultats du NI-PGT-A seront communiqués à l'équipe clinique et corrélés aux résultats cliniques pour le calcul de la valeur prédictive valeurs. Toutes les grossesses en cours se verront offrir un dépistage prénatal de routine pour les aneuploïdies fœtales.

Les détails supplémentaires concernant les protocoles de laboratoire sont les suivants :

Culture de blastocystes La culture d'embryons suivra les protocoles de routine. Au jour 3 après la fécondation, les embryons seront pipetés à plusieurs reprises à travers une série de gouttelettes de milieu de culture afin de réduire le potentiel de contamination des cellules maternelles. Les embryons seront ensuite cultivés individuellement dans des gouttelettes de 35 µL de milieu de culture d'embryons jusqu'au stade de blastocyste. Au jour 5 ou au jour 6, le développement et la qualité du blastocyste seront évalués à l'aide de critères morphologiques standard.

Collecte d'échantillons et vitrification de blastocystes Le milieu de culture de blastocystes (20µL) d'embryons sélectionnés sera collecté et transféré dans des tubes PCR et conservé à -20°C jusqu'à l'amplification du génome entier (WGA). Les blastocystes seront congelés via un protocole de vitrification de routine et stockés dans de l'azote liquide selon le protocole clinique de routine. Les échantillons seront complètement anonymisés des informations du patient et étiquetés avec un numéro d'accès avant l'expédition au laboratoire de référence (Séquence 46).

L'amplification du génome entier et le séquençage de l'ADN L'analyse NI-PGT-A sera effectuée dès réception, à l'aide d'un kit commercial conformément aux recommandations du fabricant, avec des techniciens ignorant les résultats cliniques. L'ADN sera amplifié par amplification du génome entier (WGA) et codé à barres pour préparer des bibliothèques. Les bibliothèques sont ensuite chargées sur un instrument Ion Chef pour la préparation de modèles par amplification clonale automatisée, puis chargées sur une puce pour le séquençage de l'ADN sur un système Ion Genestudio S5 Prime, avec environ 150 000 à 200 000 lectures de séquençage par échantillon. Les données sont analysées à l'aide du logiciel Ion Reporter (v5.10 ou ultérieure). La ploïdie sera mesurée à l'aide de la ligne de base Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M). Les mesures standard de contrôle de la qualité seront évaluées. Les résultats seront communiqués à l'équipe clinique 6 semaines après le transfert d'embryon et corrélés aux résultats cliniques pour le calcul des valeurs prédictives.

Population de patients :

Critère d'intégration:

Patient subissant une FIV-ICSI Âgé de 21 à 35 ans au moment de l'inscription Cycle facultatif de congélation complète Planification du transfert d'un seul embryon

Critère d'exclusion:

En cours de PGT-A, PGT-SR, PGT-M Antécédents de perte de grossesse récurrente Antécédents d'échec d'implantation récurrent Planification du transfert de plus d'un embryon

La justification de la catégorie d'âge est de contrôler les facteurs liés à l'âge autres que l'aneuploïdie qui peuvent influencer l'implantation, de sorte que les variables qui pourraient aggraver les calculs de valeur prédictive sont minimisées. Limiter la participation aux patients de moins de 35 ans optimise également la sélection des embryons de sorte que les embryons morphologiquement normaux sont très probablement en bonne santé. De plus, les patients de cette tranche d'âge présentent le risque le plus faible d'aneuploïdies cliniques telles que le syndrome de Down.

Gestion et stockage des données :

Les échantillons de recherche seront identifiés par un numéro d'accès unique, mais aucune information d'identification du patient. Les échantillons seront traités par Sequence46 avec des résultats associés au numéro d'accession. Les données seront téléchargées via un service cloud sécurisé, auquel l'investigateur principal aura accès pour fusionner avec le formulaire de rapport de cas électronique (eCRF) qui sera stocké localement au Olive Fertility Center sur un disque dur crypté qui sera sauvegardé. sur un disque local secondaire. L'eCRF contiendra le numéro de dossier médical unique et l'âge du patient, mais ne documentera pas le nom, la date de naissance ou toute autre information d'identification. Les résultats de l'analyse NI-PGT-A et les résultats cliniques seront également stockés dans l'eCRF.

Les données de recherche seront conservées pendant 5 ans après la date de publication.

Analyses statistiques:

La précision du diagnostic sera interprétée dans le contexte des valeurs prédictives positives et négatives.

Un résultat positif est une découverte compatible avec une aneuploïdie ou un mosaïcisme. Un résultat négatif est une constatation compatible avec l'euploïdie.

VPP = (Échec d'implantation + fausse couche + aneuploïdie clinique)/Tous les résultats positifs VPN = Grossesse en cours/Tous les résultats négatifs

Calcul de la taille de l'échantillon :

Cent vingt (120) patients devraient suffire pour cette étude pilote. Des recherches antérieures ont établi que chez les patients âgés de 35 ans ou moins, le rapport embryons euploïdes: aneuploïdes est d'environ 60:40. Parmi les embryons euploïdes, environ 70 % s'implanteront, dont 85 % devraient rester viables. Parmi les embryons aneuploïdes, environ 25 % s'implanteront, dont > 99 % feront une fausse couche ; le risque d'aneuploïdie clinique est inférieur à 0,5 % chez les femmes de 35 ans et moins.

Compte tenu de ces probabilités, sur les 120 patientes à recruter, 72 embryons euploïdes sont attendus, dont 50 devraient être implantés et 43 se poursuivront sous forme de grossesses viables. Sur les 48 qui devraient être aneuploïdes, 12 implanteront, dont tous devraient faire une fausse couche (le risque d'aneuploïdie clinique dans cette population est inférieur à 0,5%).

Recrutement:

Les patients qui poursuivent une FIV-ICSI au Olive Fertility Center et qui répondent aux critères d'inclusion/exclusion seront recrutés directement par les co-investigateurs. Des dépliants seront affichés à l'intérieur de la clinique.