Noninvasiivinen kromosomiseulonta alkionvalintakokeeseen (NICEST)

Hypoteesi:

Kehittyvistä alkioista käytettyyn elatusaineeseen (SCM) vapautuneen soluvapaan DNA:n (cfDNA) analyysi voi toimia ei-invasiivisena menetelmänä aneuploidian (PGT-A) preimplantaatiogeneettisessä testauksessa. Ei-valintatutkimus, jossa verrataan kliinisiä tuloksia siirrettyjen alkioiden NI-PGT-A-tuloksiin sokkomenetelmällä, luonnehtii diagnostista tarkkuutta määrittämällä positiiviset ja negatiiviset ennustusarvot

Perustelut:

In vitro -hedelmöitysprosessin (IVF) aikana terveen alkion valintaa rajoittaa mikroskooppisen ulkonäön kyvyttömyys paljastaa kromosomaalista komplementtia. Siten kromosomaalisesti normaalien alkioiden valitsemiseksi luotettavasti suoritetaan preimplantaatiogeneettinen aneuploidian (PGT-A) testaus. PGT-A vaatii biopsian alkiosta, DNA:n monistamisen ja sitten seuraavan sukupolven sekvensoinnin (NGS) kromosomien kopioluvun määrittämiseksi.

Vaikka PGT-A:n kliininen käyttökelpoisuus on osoitettu, prosessilla on rajoituksia, joista merkittävin on alkiobiopsian tarve. Tyypillisesti 5-10 solua poistetaan TE:stä sen jälkeen, kun zona pellucida on murtunut. Vaikka koulutetut embryologit voivat suorittaa toimenpiteen turvallisesti ja tehokkaasti, ilmeinen huoli alkion vahingoittumisesta on merkityksellistä. Vaikka istutus onnistuisikin, on herännyt huolta siitä, että alkion biopsia tässä vaiheessa voi johtaa komplikaatioihin, kuten keskenmenoon tai istukan toimintahäiriöihin myöhemmin raskauden aikana. Lisäksi, koska TE:n on määrä erilaistua istukan sijaan itse sikiöön, on kiistaa siitä, edustaako näiden solujen kromosomianalyysi aina sikiön kromosomikomplementtia. Näistä syistä ja koska TE-biopsia on työlästä ja kallista, PGT-A ei ole vieläkään syrjäyttänyt morfologista arviointia alkion valinnan kliinisenä standardina.

Tarkka ei-invasiivinen menetelmä alkioiden aneuploidia seulomiseksi ennen istutusta olisi ihanteellinen. Tätä varten noninvasiivisten PGT-A (NI-PGT-A) menetelmien kehittäminen on aktiivisen tutkimuksen ala. Lähestymistapa hyödyntää kykyä eristää soluton DNA (cfDNA), joka erittyy blastokystistä käytettyyn elatusaineeseen (SCM). SCM hylätään rutiininomaisesti sen jälkeen, kun alkio on poistettu viljelmästä, mutta pieniä määriä alkiosta peräisin olevaa DNA:ta voidaan eristää, monistaa ja sitten sekvensoida kromosomaalisten kopiolukujen analysointia varten. Ilmeinen etu on, että tämä prosessi voi tapahtua aiheuttamatta haittaa alkiolle. Tämän ei-invasiivisen lähestymistavan oletettu lisäetu on, että DNA:ta erittyy sekä TE:stä että sisäisestä solumassasta (ICM), mikä toimii teoriassa tarkempana esitysnä sikiön karyotyypistä kuin pelkästään TE-biopsiasta eristetty DNA.

NI-PGT-A:n käyttöönoton tekniset rajoitukset liittyvät SCM:ssä saatavilla olevan DNA:n rajoitettuun määrään. Toisin kuin muut geneettisen testauksen tavat, joissa runsaasti geneettistä materiaalia uutetaan helposti verestä, lapsivedestä tai kudosbiopsiasta, soluttoman DNA:n eritys blastokysteistä on poikkeuksellisen vähäistä. Laboratorioprotokollat ​​kehittyvät kuitenkin nopeasti, mistä on osoituksena lukuisat julkaisut, jotka ovat jo osoittaneet korkean yhdenmukaisuuden, kun kromosomaalista kopiolukua analysoidaan NI-PGT-A:lla ja perinteisellä PGT-A:lla rinnakkain.

Vaikka nämä tutkimukset ovat osoittaneet todisteita käsitteestä ja prekliinisestä validoinnista, todellinen diagnostinen tarkkuus voidaan arvioida vain arvioimalla negatiivisten (euploidisten) ja positiivisten (aneuploidisten) tulosten ennustearvoa. Tarkemmin sanottuna euploideiksi todetuilla alkioilla tulisi olla suurempi kyky jatkuvaan implantaatioon, joka etenee elävänä syntymään, kun taas aneuploidisilla alkioilla pitäisi olla dramaattisesti alhaisempi pysyvä implantaatio, tai ne ennustavat kliinistä aneuploidiaa. Ilman tiukkaa kliinistä validointia näiden tulosten käyttäminen alkioiden valintaan voi johtaa virhediagnooseihin, mikä saattaisi aiheuttaa epäterveiden alkioiden valinnan tai valinnan alkioihin, jotka olisivat voineet olla elinkelpoisia.

Sen määrittämiseksi, onko NI-PGT-A kliinisesti vankka, ehdotamme ei-valintatutkimusta, pilottitutkimusta, jossa alkion valinta suoritetaan rutiininomaisilla kliinisillä menetelmillä (eli morfologisella valinnalla). Kuitenkin sen jälkeen, kun kliininen tulos on ilmennyt, SCM analysoidaan kaupallisesti saatavilla olevilla NI-PGT-A-protokollalla sokeutetulla tavalla. Korreloimalla kliiniset tulokset NI-PGT-A-tuloksiin positiiviset ja negatiiviset ennustavat arvot voidaan laskea ilman harhaa. Koska kliinisestä rutiinista poikkeavaa interventiota ei suoriteta, alkiolle tai vanhemmalle ei aiheudu lisäriskiä.

Tämä tutkimus toimii pilottina mahdollisille tuleville kokeille. Jos NI-PGT-A:n kohtuullinen ennustearvo osoitetaan, prospektiivinen valintatutkimus voi olla perusteltua NI-PGT-A:n hyödyllisyyden tutkimiseksi kliinisissä olosuhteissa.

Tutkimus suunnittelu:

Potilaille tehdään IVF-ICSI kliinisen indikaation mukaan, ja kaikki alkiot aiotaan jäädyttää alkionsiirtoa varten. Alkioviljely noudattaa rutiiniprotokollia ja alkioiden valinta siirtoa varten suoritetaan tavanomaisten morfologisten kriteerien mukaisesti. Kaikista eläviltä vaikuttavista blastokysteistä kerätään SCM:t ja lähetetään vertailulaboratorioon (sekvenssi 46). Näytteistä poistetaan potilastiedot kokonaan ja ne merkitään liitenumerolla. NI-PGT-A-analyysi suoritetaan käyttämällä kaupallista pakkausta valmistajan suositusten mukaisesti, ja teknikot ovat sokeutuneet kliinisistä tuloksista. Kun potilaat palaavat alkionsiirtosykliin, kohdun limakalvon valmistelussa noudatetaan rutiininomaista kliinistä protokollaa. Yksi alkio valitaan rutiininomaisten morfologisten arviointikriteerien mukaan ja alkionsiirto suoritetaan standarditekniikoilla. Raskauden alkutulos dokumentoidaan seerumin hCG-testillä. Jos hCG-testi on positiivinen, varhainen raskaus varmistetaan ultraäänitutkimuksella kliinisen rutiinin mukaan. Kun kaikki potilaat ovat saaneet hoidon loppuun ja kliiniset tulokset ovat ilmenneet (epäonnistunut implantaatio, keskenmeno tai meneillään oleva raskaus (määritelty elinkelpoisuudeksi yli 13 viikkoa), NI-PGT-A-tulokset julkaistaan ​​kliiniselle ryhmälle ja korreloidaan kliinisten tulosten kanssa ennustavan arvon laskemista varten. arvot. Kaikille meneillään oleville raskauksille tarjotaan rutiini Prenataalinen seulonta sikiön aneuploidioiden varalta.

Laboratorioprotokollia koskevat lisätiedot ovat seuraavat:

Blastokystiviljelmä Alkioviljelmä noudattaa rutiiniprotokollia. Kolmantena päivänä hedelmöityksen jälkeen alkiot pipetoidaan toistuvasti kasvatusalustan pisaroiden läpi emon solukontaminaation mahdollisuuden vähentämiseksi. Sen jälkeen alkiot viljellään yksittäin 35 µl:n pisaroissa alkioviljelyalustaa blastokystivaiheeseen asti. Päivänä 5 tai 6 blastokystin kehitystä ja laatua arvioidaan standardinmukaisia ​​morfologisia kriteerejä käyttäen.

Näytteenotto ja blastokystien lasittaminen Blastocyst-viljelyelatusaine (20 µl) valituista alkioista kerätään ja siirretään PCR-putkiin ja säilytetään -20 °C:ssa koko genomin monistukseen (WGA) asti. Blastokystit jäädytetään rutiininomaisen lasitusprotokollan mukaisesti ja varastoidaan nestetypessä rutiininomaisen kliinisen protokollan mukaisesti. Näytteistä poistetaan kokonaan potilastiedot ja ne merkitään liitenumerolla ennen toimitusta vertailulaboratorioon (Sequence46).

Koko genomin monistaminen ja DNA-sekvensointi NI-PGT-A-analyysi suoritetaan vastaanoton yhteydessä käyttämällä kaupallista pakkausta valmistajan suositusten mukaisesti. Teknikot ovat sokeutuneet kliinisistä tuloksista. DNA monistetaan koko genomin amplifikaatiolla (WGA) ja viivakoodataan kirjastojen valmistamiseksi. Kirjastot ladataan sitten Ion Chef -instrumenttiin templaatin valmistusta varten automatisoidulla kloonaalisella amplifikaatiolla ja sitten ladataan sirulle DNA-sekvensointia varten Ion Genestudio S5 Prime -järjestelmässä, noin 150 000 - 200 000 sekvensointilukemaa näytettä kohti. Tiedot analysoidaan käyttämällä Ion Reporter -ohjelmistoa (v5.10 tai uudempi). Ploidia mitataan käyttämällä perusviivaa, Ion ReproSeq Low-Coverage Whole-Genome (99M) -perusviivaa. Standardilaadunvalvontatoimenpiteet arvioidaan. Tulokset julkaistaan ​​kliiniselle ryhmälle 6 viikkoa alkionsiirron jälkeen, ja ne korreloidaan kliinisiin tuloksiin ennustavien arvojen laskemista varten.

Potilaspopulaatio:

Sisällyttämiskriteerit:

Potilas, jolle tehdään IVF-ICSI, 21-35-vuotias ilmoittautumishetkellä Elektiivinen jäädytysjakso Yksittäisen alkionsiirron suunnittelu

Poissulkemiskriteerit:

Käynnissä PGT-A, PGT-SR, PGT-M Toistuvan raskauden menetyksen historia Toistuvan implantaation epäonnistumisen historia. Enemmän kuin 1 alkion siirron suunnittelu

Ikäluokan perusteena on valvoa muita ikään liittyviä tekijöitä kuin aneuploidia, jotka voivat vaikuttaa implantaatioon, joten muuttujat, jotka voisivat yhdistää ennustusarvolaskelmia, ovat minimoituja. Osallistumisen rajoittaminen alle 35-vuotiaisiin potilaisiin optimoi myös alkioiden valinnan siten, että morfologisesti normaalit alkiot ovat todennäköisesti terveitä. Lisäksi tämän ikäluokan potilailla on pienin riski kliinisiin aneuploidioihin, kuten Downin oireyhtymään.

Tiedonhallinta ja tallennus:

Tutkimusnäytteet tunnistetaan yksilöllisellä liitenumerolla, mutta ei potilaan tunnistetietoja. Näytteet käsittelee Sequence46, ja tulokset liittyvät liittymisnumeroon. Tiedot ladataan suojatun pilvipalvelun kautta, jota ensisijainen tutkija käyttää ja sulautuu sähköiseen tapausraporttilomakkeeseen (eCRF), joka tallennetaan paikallisesti Olive Fertility Centeriin salatulle kiintolevylle, joka on suojattu toissijaiselle paikalliselle asemalle. eCRF sisältää potilaan yksilöllisen sairauskertomuksen numeron ja iän, mutta se ei dokumentoi nimeä, syntymäpäivää tai muita tunnistetietoja. NI-PGT-A-analyysin tulokset ja kliiniset tulokset tallennetaan myös eCRF:ään.

Tutkimustietoja säilytetään 5 vuotta julkaisupäivästä.

Tilastollinen analyysi:

Diagnostinen tarkkuus tulkitaan positiivisten ja negatiivisten ennustearvojen yhteydessä.

Positiivinen tulos on löydös, joka on sopusoinnussa aneuploidia tai mosaiikki. Negatiivinen tulos on havainto, joka vastaa euploidia.

PPV = (epäonnistunut implantaatio + keskenmeno + kliininen aneuploidia) / kaikki positiiviset tulokset NPV = meneillään oleva raskaus / kaikki negatiiviset tulokset

Näytteen kokolaskenta:

Satakaksikymmentä (120) potilasta riittää tähän pilottitutkimukseen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että 35-vuotiailla tai sitä nuoremmilla potilailla euploidien ja aneuploidisten alkioiden suhde on noin 60:40. Euploidisista alkioista noin 70 % implantoituu, joista 85 %:n pitäisi jatkaa elinkelpoisuutta. Aneuploidisista alkioista noin 25 % implantoituu, joista > 99 % keskenmeno; kliinisen aneuploidian riski on alle 0,5 % 35-vuotiailla ja sitä nuoremmilla naisilla.

Kun otetaan huomioon nämä todennäköisyydet, 120 potilaasta, jotka otetaan mukaan, odotetaan 72 euploidista alkiota, joista 50 pitäisi implantoida ja 43 jatkuu jatkuvana, elinkelpoisena raskaudena. Niistä 48:sta, joiden odotetaan olevan aneuploidisia, 12 implantoidaan, joista kaikkien pitäisi saada keskenmeno (kliinisen aneuploidian mahdollisuus tässä populaatiossa on alle 0,5 %).

Rekrytointi:

Potilaat, jotka suorittavat IVF-ICSI-hoitoa Olive Fertility Centerissä ja täyttävät sisällyttämis-/poissulkemiskriteerit, rekrytoidaan suoraan apututkijoiden toimesta. Esitteet postitetaan klinikalla.