成人における肺炎球菌性鼻咽頭および中咽頭保菌

研究センター:

研究は以下によって実施されます。

1. ヴォイボディナ公衆衛生研究所

   • 疾病管理予防センターと微生物センター

2. ノヴィサドのヘルスケアセンター

   • 総合診療科。

サンプル処理 NP および OP キャリッジを確認するために、サンプリングには NP および OP スワブが含まれます。 綿棒はノヴィサドのヘルスケアセンターの一般開業医によって収集され、収集後24時間以内にノヴィサドのヴォイボディナ公衆衛生研究所の微生物学センターに輸送されます。 滅菌綿棒ワイヤーを前鼻孔に挿入し、NP 綿棒の壁を優しくこすり、すぐに輸送媒体 (Copan Venturi Transystem、Brescia、イタリア) に置きます。

実験室手順 実験室内で、NP スワブを分析します。スワブを接種した STGG 培地 200 μl を、0.5% 酵母エキス (THY) およびウサギ血清 1 ml を含む Todd Hewitt ブロス 5.0 ml に移し、35 ～ 37 ℃でインキュベートします。 ℃で6時間。 培養したブロスを羊血液寒天培地上にプレーティングし、5% CO2 中で 35 ～ 37 °C でインキュベートします。 １８～２４時間のインキュベーション後、プレートを、連鎖球菌に似たα溶血性コロニーの出現について検査する。 陽性サンプルは培養され、オプトチンディスクと胆汁溶解度検査が実行されます。

分子血清型検査

DNA 抽出 PCR 反応用の DNA 抽出物を得るには、一晩増殖させた血液寒天プレートを 300 μl の 0.85% NaCl に懸濁し、70 °C で 15 分間加熱し、2 分間回転させ、上清を除去します。 ペレットを、10μlのムタノリシンおよび8μlのヒアルロニダーゼを添加した50μlのTE緩衝液に懸濁し、37℃で30分間(一晩まで)維持し、100℃で10分間加熱し、4分間遠心する。 2.5μl以下の上清をDNA鋳型として使用します。 抽出物は PCR 検査まで -20°C で保存されます (9)。

肺炎球菌の同定 肺炎球菌の同定は、CDC および Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1、Low RoxTM (Quanta Biosciences、ビバリー、米国) が推奨するプライマーおよびプローブを使用して lytA 遺伝子を増幅することによって達成されます (10)。 LytA 陽性サンプルは、血清型を特定するためにさらに分析されます。

血清型の同定 従来のマルチプレックス PCR アッセイは、CDC が推奨する肺炎球菌血清型推定用のスキームとプライマー、および 2X PCR バッファー - QIAGEN マルチプレックス PCR キット (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を使用して、一連のマルチプレックス反応として実行されます。 PCR産物は、臭化エチジウムで染色された2% NuSieveアガロースゲル(Cambrex Bio Science, Inc.、メイン州ロックランド)上で分析されます。 ゲル画像は BioDocAnalyze システム (Analytik Jena、イエナ、ドイツ) に記録されます。

従来のPCRでは困難な場合には、オプションでリアルタイムPCRを実施します。 ITは、血清型の地理的蔓延に基づいてCDCが推奨するスキームを使用して、21の血清型を含む一連の21のモノプレックスアッセイとして実施されます。 アッセイは連続三重フォーマット (1 つの反応で 3 つの標的/血清型) で多重化され、それぞれが FAM、Rox (または Cy5)、および Hex チャネル上の標的を検出します。 反応は、特定のプライマーおよびプローブと Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific、Waltham、米国) を使用して、ABI 7500 Instruments (Thermo Fisher Scientific、Waltham、米国) で実行されます。

感受性試験 オプトチン、オキサシリン、ノルフロキサシン、エリトロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリンおよびトリメトロプリムスルホメトキサゾールに対する Spn 分離株の感受性は、欧州抗菌感受性試験委員会 (EUCAST、www.eucast.org) に従って拡散法によって決定されます。

このベースライン評価では、現在の結果のみを説明的に提示することが考慮されていますが、比較分析のために個別に考慮されていません。

各患者に対して実施された臨床検査の結果は、患者物質のサンプリングを指示した選出された医師に転送されます。

研究手順 成人は、ノヴィサドのヘルスケアセンターでの健康診断中に、選出された医師によって採用されます。

被験者からは、研究目的を口頭および書面で説明（別紙１）した後、インフォームドコンセント（別紙２）を得てから登録します。 参加者から得た個人情報および機密情報は、サンプリング日、年齢、性別、過去の上気道感染症に関するデータ、参加者の世帯に住む0～10歳の子供（兄弟）の数などの人口統計情報を除き、削除されます。肺炎球菌およびインフルエンザの予防接種歴（インフルエンザの予防接種は肺炎球菌の重複感染を防ぐ可能性があるため）、参加者とその家族の喫煙習慣、および自宅居住に関する情報（調査票 - 付録 3）。

サンプルは、研究対象ごとに 1 つの NP スワブとして提供されます。 すべての参加者は 1 回だけ割り当てられます。

確定症例とは、検査（PCRまたはELISA）後に陽性結果が得られた、臨床検査を受けたすべての参加者です。

統計分析とサンプルサイズの正当化 データの収集 ノヴィサドからのアンケートによって得られた全回答者の特徴、参加者のサンプルの臨床検査結果、および Spn 血清型の最終的な特徴付けは、特別に設計されたデータベースに入力されます。 参加者の個人情報は削除させていただきます。

研究調査員と統計学者が収集したデータを分析します。

サンプルサイズの正当性 集団有病率を推定する研究のサンプルサイズ計算 (11) に従って、350 ～ 500 個のサンプルが収集される予定です。 Spn に対して最大 10% の PCR 陽性の肺炎球菌が検出されると考えられます。 50 歳以上の成人の総数は約 120,000 人であるため、対象人口全体の最大 0.4% までのサンプルを収集すると予想されます。

期待される結果 研究を慎重に実施した結果、50 歳以上の成人における Spn 保菌者は総人口の 10% 未満になると予想されました。 さらに、PPV または PCV の対象となる Spn 血清型は、検査対象者の全体分布における血清型の 60% 以上と 50% 以上を占めると推定されます。

統計的方法 50 歳以上の参加者における危険因子と NP および OP の肺炎球菌保菌との関連を調査します。 対象となる集団における危険因子として次の要因が検討されます: 年齢、性別、過去の上気道感染症に関するデータ、肺炎球菌およびインフルエンザの予防接種歴のある参加者の世帯に居住する 0 ～ 10 歳の子供 (兄弟) の数、参加者とその家族の喫煙習慣、自宅居住地に関する情報。 これらの要因は、単変量解析および多変量解析 (該当する場合) によって分析されます。 また、鼻咽頭培養が Spn 陽性であった参加者の割合としての NP および OP 保菌率と、対応する 95% 信頼区間が推定されます。 すべての記述的分析は、SPSS Statistics ソフトウェア バージョン 21.0 (IBM Corp.、米国ニューヨーク州アーモンク) を使用して実行されます。