Pneumokok nasopharyngeal og oropharyngeal transport hos voksne

Forskningscentre:

Forskningen vil blive udført af:

1. Institut for Folkesundhed i Vojvodina

   • Center for Sygdomsbekæmpelse og Forebyggelse og Center for Mikrobiologi

2. Sundhedscenter i Novi Sad

   • Institut for Almen Medicin.

Prøvebehandling For at bekræfte NP- og OP-transporten vil prøveudtagningen omfatte NP- og OP-podninger. Podninger vil blive indsamlet af de praktiserende læger i sundhedscentret i Novi Sad og vil blive transporteret inden for 24 timer efter indsamlingen til Center for Mikrobiologi ved Institut for Folkesundhed i Vojvodina, Novi Sad. De sterile vatpinde med vattråd indsættes i de forreste næser, gnides forsigtigt på NP-podepindens væg og placeres straks i transportmedium (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italien).

Laboratorieprocedure Inden for laboratoriet vil NP-podepinde blive analyseret med 200 μl podepodede STGG-medier, der overføres til 5,0 ml Todd Hewitt-bouillon indeholdende 0,5% gærekstrakt (THY) og 1 ml kaninserum og inkuberes ved 35-37°C. °C i seks timer. Den dyrkede bouillon udplades på fåreblodagar og inkuberes i 5 % CO2 ved 35-37 °C. Efter 18-24 timers inkubation vil pladerne blive undersøgt for forekomsten af ​​alfa-hæmolytiske kolonier, der ligner streptokokker. Positive prøver vil blive dyrket, og optochin disc og galdeopløselighedstest vil blive udført.

Molekylær serotypning

DNA-ekstraktion For at opnå DNA-ekstrakter til PCR-reaktioner vil en vækst af blodagarplade natten over blive suspenderet i 300 μl 0,85 % NaCl, opvarmet til 70 °C i 15 minutter, centrifugeret i 2 minutter, og supernatanten vil blive fjernet. Pellet vil blive suspenderet i 50 μl TE-buffer med tilsætning af 10 μl mutanolysin og 8 μl hyaluronidase, holdt ved 37 °C i 30 minutter (til natten over), opvarmet i 10 minutter ved 100 °C og centrifugeret i 4 minutter. Der vil ikke blive brugt mere end 2,5 μl supernatant som DNA-skabelon. Ekstrakter vil blive opbevaret ved -20°C indtil PCR-test (9).

Identifikation af S. pneumoniae Identifikation af S. pneumoniae vil blive opnået ved at amplificere lytA-genet ved hjælp af primere og prober anbefalet af CDC og Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) (10). LytA-positive prøver vil blive yderligere analyseret for serotype-identifikation.

Serotypeidentifikation Konventionelle multiplekse PCR-assays vil blive udført som en række multiplekse reaktioner, ved hjælp af CDC anbefalede skemaer og primere til pneumokok serotypededuktion og 2X PCR-buffer - QIAGEN Multiplex PCR-kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). PCR-produkterne vil blive analyseret på 2% NuSieve agarosegeler (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), farvet med ethidiumbromid. Gel billeder vil blive optaget BioDocAnalyze system (Analytik Jena, Jena, Tyskland).

Real Time PCR vil blive udført valgfrit i tilfælde af problemer med konventionel PCR. IT vil blive udført som en serie af 21 monoplex assays omfattende 21 serotyper ved hjælp af CDC anbefalede skemaer baseret på geografisk forekomst af serotyper. Assayene multiplekses i et sekventielt triplex-format (tre mål/serotyper i én reaktion), der hver detekterer mål på FAM-, Rox- (eller Cy5)- og Hex-kanaler. Reaktioner vil blive udført på ABI 7500-instrumenter (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), ved hjælp af specifikke primere og prober og Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Følsomhedstestning Spn-isolaters følsomhed over for optochin, oxacilin, norfloxacin, erytromycin, clindamycin, tetracyclin og trimetroprim-sulfometoxazol vil blive bestemt ved diffusionsmetoden ifølge European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST.org, www.eucast).

Denne baseline vurdering tager hensyn til kun at præsentere beskrivende aktuelle resultater, men de tages ikke separat i betragtning til sammenlignende analyse.

Resultaterne af laboratorieundersøgelser, udført for hver patient, vil videresendes til valgte læger, som indikerede prøveudtagning af patientmateriale.

Undersøgelsesprocedurer Voksne vil blive rekrutteret under deres helbredsundersøgelse på Health Care Center i Novi Sad af deres valgte læge.

Efter at have givet en mundtlig og skriftlig forklaring af forskningsformålet (bilag 1), vil der blive indhentet informeret samtykke (bilag 2) fra forsøgspersoner før tilmeldingen. Personlige og fortrolige oplysninger indhentet fra deltagere vil blive fjernet, bortset fra demografiske oplysninger, herunder prøveudtagningsdato, alder, køn, data om tidligere øvre luftvejsinfektion, antal børn (søskende) i alderen 0-10 år, der bor i deltagernes husstand med pneumokok- og influenzavaccinationsanamnese (fordi influenzaimmunisering kan forhindre pneumokok-superinfektioner), deltagernes og deres husstandsmedlemmers rygevaner og oplysningerne om hjemmet (Spørgeskema - Bilag 3).

Prøver vil blive leveret som én NP podning pr. forsøgsperson. Hver deltager vil kun blive tildelt én gang.

Bekræftet tilfælde er enhver laboratorietestet deltager, hvor der efter test (PCR eller ELISA) opnås et positivt resultat.

Statistisk analyse og prøvestørrelse Begrundelse Indsamling af data Karakteristika for alle respondenter erhvervet ved spørgeskema fra Novi Sad, testresultaterne af laboratorietestning af prøver af deltagere og den endelige karakterisering af Spn-serotyper vil blive indtastet i en specialdesignet database. Personoplysninger om deltagere vil blive fjernet.

Undersøger af forskningen sammen med statistiker vil analysere de indsamlede data.

Begrundelse for prøvestørrelse I overensstemmelse med stikprøvestørrelsesberegningen for en undersøgelse, der estimerer en populationsprævalens (11), er det planlagt, at der skal indsamles mellem 350 og 500 prøver. Vi antager at detektere pneumokokker i op til 10 % PCR-positive for Spn. Det samlede antal voksne ældre end 50 år er omkring 120.000, og derfor forventer vi at indsamle stikprøven op til 0,4 % af den samlede målpopulation.

Forventede resultater Efter omhyggelig implementering af forskningen forventede vi, at Spn-transport blandt voksne over 50 år vil være til stede hos mindre end 10% af den samlede befolkning. Derudover antager vi, at Spn-serotyper dækket af PPV eller PCV vil repræsentere mere end 60% og 50% af serotyperne i den samlede fordeling blandt testede forsøgspersoner.

Statistiske metoder Vi vil undersøge sammenhænge mellem risikofaktorer og NP- og OP-transport af pneumokokker hos deltagere i alderen over 50 år. Følgende faktorer vil blive undersøgt som mulige risikofaktorer i den dækkede befolkning: alder, køn, data om tidligere øvre luftvejsinfektion, antal børn (søskende) i alderen 0-10 år bosat i husstanden af ​​deltagere med pneumokok- og influenzavaccinationshistorie, deltagernes og deres husstandsmedlemmers rygevaner og oplysningerne om hjemmet. Disse faktorer vil blive analyseret ved univariate og multivariate analyser (hvis det er relevant). Også prævalensen af ​​NP- og OP-bæring som andelen af ​​deltagere, hvis nasopharyngeale kulturer var positive for Spn og tilsvarende 95 % konfidensintervaller, vil blive estimeret. Alle beskrivende analyser vil blive udført ved hjælp af SPSS Statistics-softwaren Version 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).