Nasopharyngealer und oropharyngealer Transport durch Pneumokokken bei Erwachsenen

Forschungszentren):

Die Forschung wird durchgeführt von:

1. Institut für öffentliche Gesundheit der Vojvodina

   • Zentrum für Krankheitskontrolle und Prävention und Zentrum für Mikrobiologie

2. Gesundheitszentrum von Novi Sad

   • Abteilung für Allgemeinmedizin.

Probenverarbeitung Zur Bestätigung des NP- und OP-Transports umfasst die Probenahme NP- und OP-Tupfer. Die Abstrichtupfer werden von den Allgemeinmedizinern im Gesundheitszentrum von Novi Sad gesammelt und innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme zum Zentrum für Mikrobiologie des Instituts für öffentliche Gesundheit der Vojvodina in Novi Sad transportiert. Die sterilen Drahttupfer mit Baumwollspitze werden in die vorderen Nasenlöcher eingeführt, sanft an der NP-Tupferwand gerieben und sofort in Transportmedium (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italien) gegeben.

Laborverfahren Im Labor werden NP-Abstriche analysiert, indem 200 μl mit Tupfern inokuliertes STGG-Medium in 5,0 ml Todd-Hewitt-Brühe mit 0,5 % Hefeextrakt (THY) und 1 ml Kaninchenserum überführt und bei 35–37 °C inkubiert werden °C für sechs Stunden. Die Kulturbrühe wird auf Schafblutagar ausplattiert und in 5 % CO2 bei 35–37 °C inkubiert. Nach 18–24 Stunden Inkubation werden die Platten auf das Auftreten von alpha-hämolytischen Kolonien untersucht, die Streptokokken ähneln. Positive Proben werden kultiviert und ein Optochin-Scheiben- und Gallenlöslichkeitstest durchgeführt.

Molekulare Serotypisierung

DNA-Extraktion Um DNA-Extrakte für PCR-Reaktionen zu erhalten, wird eine über Nacht gewachsene Blutagarplatte in 300 μl 0,85 % NaCl suspendiert, 15 Minuten lang auf 70 °C erhitzt, 2 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand wird entfernt. Das Pellet wird in 50 μl TE-Puffer mit einem Zusatz von 10 μl Mutanolysin und 8 μl Hyaluronidase suspendiert, 30 Minuten (bis über Nacht) bei 37 °C gehalten, 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und 4 Minuten lang zentrifugiert. Als DNA-Matrize werden nicht mehr als 2,5 μl Überstand verwendet. Die Extrakte werden bis zum PCR-Test bei -20 °C gelagert (9).

Identifizierung von S. pneumoniae Die Identifizierung von S. pneumoniae wird durch die Amplifikation des lytA-Gens mithilfe von Primern und Sonden erreicht, die von CDC und Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) empfohlen werden (10). LytA-positive Proben werden zur Identifizierung des Serotyps weiter analysiert.

Identifizierung des Serotyps Herkömmliche Multiplex-PCR-Assays werden als eine Reihe von Multiplex-Reaktionen unter Verwendung der von der CDC empfohlenen Schemata und Primer für die Ableitung des Pneumokokken-Serotyps und 2X PCR-Puffer – QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die PCR-Produkte werden auf 2 % NuSieve-Agarosegelen (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME) analysiert, die mit Ethidiumbromid gefärbt sind. Gelbilder werden mit dem BioDocAnalyze-System (Analytik Jena, Jena, Deutschland) aufgezeichnet.

Bei Schwierigkeiten mit der konventionellen PCR wird optional eine Echtzeit-PCR durchgeführt. Die IT wird als eine Reihe von 21 Monoplex-Assays durchgeführt, die 21 Serotypen umfassen, wobei die von der CDC empfohlenen Schemata auf der Grundlage der geografischen Prävalenz der Serotypen verwendet werden. Die Tests werden in einem sequentiellen Triplex-Format gemultiplext (drei Ziele/Serotypen in einer Reaktion), wobei jeweils Ziele auf FAM-, Rox- (oder Cy5) und Hex-Kanälen erkannt werden. Die Reaktionen werden auf ABI 7500-Instrumenten (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) unter Verwendung spezifischer Primer und Sonden und Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) durchgeführt.

Empfindlichkeitsprüfung Die Empfindlichkeit von Spn-Isolaten gegenüber Optochin, Oxacilin, Norfloxacin, Erytromycin, Clindamycin, Tetracyclin und Trimetroprim-Sulfometoxazol wird durch die Diffusionsmethode gemäß dem Europäischen Komitee für antimikrobielle Empfindlichkeitstests (EUCAST, www.eucast.org) bestimmt.

Bei dieser Basisbewertung wird berücksichtigt, dass nur die aktuellen Ergebnisse deskriptiv dargestellt werden, sie werden jedoch nicht separat für die vergleichende Analyse berücksichtigt.

Die Ergebnisse der für jeden Patienten durchgeführten Labortests werden an ausgewählte Ärzte weitergeleitet, die eine Probenahme von Patientenmaterial angegeben haben.

Studienverfahren Erwachsene werden während ihrer Gesundheitsuntersuchung im Gesundheitszentrum von Novi Sad von ihrem gewählten Arzt rekrutiert.

Nach einer mündlichen und schriftlichen Erläuterung des Forschungsziels (Anhang 1) wird vor der Einschreibung die Einverständniserklärung (Anhang 2) der Probanden eingeholt. Persönliche und vertrauliche Informationen der Teilnehmer werden entfernt, mit Ausnahme demografischer Informationen, einschließlich Datum der Probenahme, Alter, Geschlecht, Daten zu früheren Infektionen der oberen Atemwege und Anzahl der Kinder (Geschwister) im Alter von 0 bis 10 Jahren, die im Haushalt der Teilnehmer leben mit Pneumokokken- und Influenza-Impfgeschichte (da Influenza-Impfungen Pneumokokken-Superinfektionen verhindern können), Rauchgewohnheiten der Teilnehmer und ihrer Haushaltsmitglieder sowie Informationen über den Wohnort (Umfragefragebogen – Anhang 3).

Die Proben werden als NP-Abstrich pro Studienteilnehmer bereitgestellt. Jeder Teilnehmer wird nur einmal zugeteilt.

Bestätigter Fall ist jeder im Labor getestete Teilnehmer, bei dem nach der Testung (PCR oder ELISA) ein positives Ergebnis vorliegt.

Statistische Analyse und Begründung der Stichprobengröße. Die Sammlung der Datenmerkmale aller Befragten, die per Fragebogen aus Novi Sad erfasst wurden, die Testergebnisse der Labortests von Proben der Teilnehmer und die endgültige Charakterisierung der Spn-Serotypen werden in eine speziell entwickelte Datenbank eingegeben. Persönliche Daten der Teilnehmer werden entfernt.

Der Forschungsforscher wird zusammen mit dem Statistiker die gesammelten Daten analysieren.

Begründung der Stichprobengröße Gemäß der Stichprobengrößenberechnung für eine Studie zur Schätzung der Bevölkerungsprävalenz (11) ist die Entnahme von zwischen 350 und 500 Proben geplant. Wir gehen davon aus, Pneumokokken in bis zu 10 % PCR-positiven Spn-Patienten nachzuweisen. Die Gesamtzahl der Erwachsenen über 50 Jahre beträgt etwa 120.000, und daher gehen wir davon aus, dass die Stichprobe bis zu 0,4 % der gesamten Zielbevölkerung umfassen wird.

Erwartete Ergebnisse Nach sorgfältiger Durchführung der Forschung gingen wir davon aus, dass Spn-Träger bei Erwachsenen über 50 Jahren bei weniger als 10 % der Gesamtbevölkerung auftreten werden. Darüber hinaus gehen wir davon aus, dass von PPV oder PCV abgedeckte Spn-Serotypen mehr als 60 % bzw. 50 % der Serotypen in der Gesamtverteilung unter den getesteten Probanden ausmachen.

Statistische Methoden Wir werden Zusammenhänge zwischen Risikofaktoren und der NP- und OP-Übertragung von Pneumokokken bei Teilnehmern über 50 Jahren untersuchen. Die folgenden Faktoren werden als mögliche Risikofaktoren in der abgedeckten Bevölkerung untersucht: Alter, Geschlecht, Daten zu früheren Infektionen der oberen Atemwege, Anzahl der Kinder (Geschwister) im Alter von 0 bis 10 Jahren, die im Haushalt von Teilnehmern mit Pneumokokken- und Grippeimpfungsgeschichte leben, Rauchgewohnheiten der Teilnehmer und ihrer Haushaltsmitglieder sowie Angaben zum Wohnort. Diese Faktoren werden durch univariate und multivariate Analysen (falls zutreffend) analysiert. Außerdem wird die Prävalenz von NP- und OP-Trägern als Anteil der Teilnehmer, deren Nasopharynxkulturen positiv für Spn waren, und entsprechende 95 %-Konfidenzintervalle geschätzt. Alle deskriptiven Analysen werden mit der SPSS Statistics-Software Version 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) durchgeführt.