Pneumokokk nasofaryngeal og orofaryngeal transport hos voksne

Forskningssenter(er):

Forskningen vil bli utført av:

1. Institutt for folkehelse i Vojvodina

   • Senter for sykdomskontroll og forebygging og Senter for mikrobiologi

2. Helsesenteret i Novi Sad

   • Institutt for allmennmedisin.

Prøvebehandling For å bekrefte NP- og OP-transporten vil prøvetakingen inkludere NP- og OP-pinneprøver. Vatter vil bli samlet inn av allmennleger i helsesenteret i Novi Sad og vil transporteres innen 24 timer etter innsamling til Senter for mikrobiologi ved Institutt for folkehelse i Vojvodina, Novi Sad. De sterile bomullspinnene vil bli satt inn i de fremre nesene, gnidd forsiktig på NP-pinneveggen og umiddelbart plassert i transportmedium (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italia).

Laboratorieprosedyre Innenfor laboratoriet vil NP-pinneprøver bli analysert med 200 μl med vattpinneinokulert STGG-medium som overføres til 5,0 ml Todd Hewitt-buljong som inneholder 0,5 % gjærekstrakt (THY) og 1 ml kaninserum og inkuberes ved 35-37 grader. °C i seks timer. Dyrket buljong vil bli belagt på saueblodagar og inkubert i 5 % CO2 ved 35-37 °C. Etter 18-24 timers inkubasjon vil platene undersøkes for utseende av alfa-hemolytiske kolonier som ligner streptokokker. Positive prøver vil bli dyrket, og optochinskive og galleløselighetstest vil bli utført.

Molekylær serotyping

DNA-ekstraksjon For å oppnå DNA-ekstrakter for PCR-reaksjoner, vil en vekst av blodagarplate over natten bli suspendert i 300 μl 0,85 % NaCl, oppvarmet til 70 °C i 15 minutter, sentrifugert i 2 minutter og supernatanten vil bli fjernet. Pellet vil bli suspendert i 50 μl TE-buffer med tilsetning av 10 μl mutanolysin og 8 μl hyaluronidase, holdt ved 37 °C i 30 minutter (til over natten), oppvarmet i 10 minutter ved 100 °C og sentrifugert i 4 minutter. Ikke mer enn 2,5 μl supernatant vil bli brukt som DNA-mal. Ekstrakter vil bli lagret ved -20°C frem til PCR-testing (9).

Identifikasjon av S. pneumoniae Identifikasjon av S. pneumoniae vil bli oppnådd ved å amplifisere lytA-genet ved bruk av primere og prober anbefalt av CDC og Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) (10). LytA-positive prøver vil bli analysert videre for serotypeidentifikasjon.

Serotypeidentifikasjon Konvensjonelle multiplekse PCR-analyser vil bli utført som en serie multiplekse reaksjoner, ved bruk av CDC-anbefalte skjemaer og primere for pneumokokkserotypededuksjon og 2X PCR-buffer - QIAGEN Multiplex PCR-sett (Qiagen, Hilden, Tyskland). PCR-produktene vil bli analysert på 2 % NuSieve agarosegeler (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), farget med etidiumbromid. Gelbilder vil bli tatt opp BioDocAnalyze-systemet (Analytik Jena, Jena, Tyskland).

Sanntids-PCR vil bli utført valgfritt i tilfelle problemer med konvensjonell PCR. IT vil bli utført som en serie på 21 monopleksanalyser som omfatter 21 serotyper ved bruk av CDC anbefalte ordninger basert på geografisk prevalens av serotyper. Analysene multiplekses i et sekvensielt tripleksformat (tre mål/serotyper i en reaksjon), hver detekterer mål på FAM-, Rox- (eller Cy5)- og Hex-kanaler. Reaksjoner vil bli utført på ABI 7500 Instruments (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), ved bruk av spesifikke primere og prober og Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Følsomhetstesting Spn-isolaters følsomhet overfor optochin, oksacilin, norfloxacin, erytromycin, clindamycin, tetracyklin og trimetroprim-sulfometoksazol vil bli bestemt av diffusjonsmetoden i henhold til European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST.org, www.eucast).

Denne grunnlinjevurderingen tar i betraktning å presentere kun beskrivende nåværende resultater, men de tas ikke i betraktning separat for komparativ analyse.

Resultatene av laboratorietesting, utført for hver pasient, vil videresendes til valgte leger som indikerte prøvetaking av pasientmateriale.

Studieprosedyrer Voksne vil bli rekruttert under deres helseundersøkelse ved Health Care Centre of Novi Sad av deres valgte lege.

Etter å ha gitt en muntlig og skriftlig forklaring av forskningsmålet (vedlegg 1), vil informert samtykke (vedlegg 2) innhentes fra forsøkspersoner før påmelding. Personlig og konfidensiell informasjon innhentet fra deltakere vil bli fjernet, bortsett fra demografisk informasjon, inkludert dato for prøvetaking, alder, kjønn, data om tidligere øvre luftveisinfeksjon, antall barn (søsken) i alderen 0-10 år som bor i husstanden til deltakerne med pneumokokk- og influensavaksinasjonsanamnese (fordi influensavaksinering kan forhindre pneumokokk-superinfeksjoner), røykevaner til deltakere og deres husstandsmedlemmer og informasjon om bolig (Spørreskjema - vedlegg 3).

Prøver vil bli gitt som én NP vattpinne per forsøksperson. Hver deltaker vil kun bli tildelt én gang.

Bekreftet tilfelle er hver laboratorietestet deltaker der et positivt resultat oppnås etter testing (PCR eller ELISA).

Statistisk analyse og prøvestørrelse Begrunnelse Innsamling av dataene Kjennetegnene til alle respondentene som er anskaffet ved spørreskjema fra Novi Sad, testresultatene fra laboratorietesting av prøver av deltakere og den endelige karakteriseringen av Spn-serotyper vil bli lagt inn i en spesialdesignet database. Personopplysninger om deltakere vil bli fjernet.

Etterforsker av forskningen sammen med statistiker vil analysere de innsamlede dataene.

Begrunnelse for prøvestørrelse I henhold til prøvestørrelsesberegningen for en studie som estimerer en populasjonsprevalens (11), er det planlagt å samle inn mellom 350 og 500 prøver. Vi antar å oppdage pneumokokker i opptil 10 % PCR-positive til Spn. Totalt antall voksne eldre enn 50 år er rundt 120 000, og derfor forventer vi å samle utvalget opp til 0,4 % av den totale målpopulasjonen.

Forventede resultater Etter nøye gjennomføring av forskningen forventet vi at Spn-transport blant voksne eldre enn 50 år vil være tilstede hos mindre enn 10 % av den totale befolkningen. I tillegg antar vi at Spn-serotyper dekket av PPV eller PCV vil representere mer enn 60 % og 50 % av serotypene i total fordeling blant testede personer.

Statistiske metoder Vi vil undersøke assosiasjoner mellom risikofaktorer og NP- og OP-bæring av pneumokokker hos deltakere over 50 år. Følgende faktorer vil bli undersøkt som mulige risikofaktorer i dekket populasjon: alder, kjønn, data om tidligere øvre luftveisinfeksjon, antall barn (søsken) i alderen 0-10 år bosatt i husholdningen til deltakere med pneumokokk- og influensavaksinasjonshistorie, røykevaner til deltakere og deres husstandsmedlemmer og informasjon om hjemmebolig. Disse faktorene vil bli analysert ved univariate og multivariate analyser (hvis hensiktsmessig). Også prevalensen av NP- og OP-bæring som andelen deltakere hvis nasofaryngeale kulturer var positive for Spn og tilsvarende 95 % konfidensintervaller vil bli estimert. Alle beskrivende analyser vil bli utført ved hjelp av SPSS Statistics-programvaren versjon 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).