Transporte Nasofaríngeo e Orofaríngeo Pneumocócico em Adultos

Centro(s) de pesquisa:

A pesquisa será realizada pelo:

1. Instituto de Saúde Pública de Vojvodina

   • Centro de Controle e Prevenção de Doenças e Centro de Microbiologia

2. Centro de Saúde de Novi Sad

   • Departamento de Medicina Geral.

Processamento da amostra Para confirmar o transporte NP e OP, a amostragem incluirá zaragatoas NP e OP. As zaragatoas serão recolhidas pelos médicos de clínica geral no Centro de Saúde de Novi Sad e transportadas, no prazo de 24h após a recolha, para o Centro de Microbiologia do Instituto de Saúde Pública de Vojvodina, Novi Sad. Os swabs estéreis com ponta de algodão serão inseridos nas narinas anteriores, esfregados suavemente na parede do swab do NP e imediatamente colocados em meio de transporte (Copan Venturi Transsystem, Brescia, Itália).

Procedimento laboratorial Dentro do laboratório, os swabs NP serão analisados ​​por 200 μl de meio STGG inoculado com swab serão transferidos para 5,0 ml de caldo Todd Hewitt contendo 0,5% de extrato de levedura (THY) e 1 ml de soro de coelho e incubados a 35-37 °C por seis horas. O caldo cultivado será semeado em ágar sangue de ovelha e incubado em 5% de CO2 a 35-37 °C. Após 18-24 horas de incubação, as placas serão examinadas quanto ao aparecimento de colônias alfa-hemolíticas semelhantes a estreptococos. As amostras positivas serão cultivadas e o disco de optoquina e o teste de bile solubilidade serão realizados.

sorotipagem molecular

Extração de DNA Para obter extratos de DNA para reações de PCR, um crescimento noturno de placa de ágar sangue será suspenso em 300 μl de NaCl 0,85%, aquecido a 70 °C por 15 min, centrifugado por 2 min e o sobrenadante será removido. O pellet será suspenso em 50 μl de tampão TE com adição de 10 μl de mutanolisina e 8 μl de hialuronidase, mantido a 37°C por 30 min (durante a noite), aquecido por 10 min a 100°C e centrifugado por 4 min. Não mais do que 2,5 μl de sobrenadante serão usados ​​como modelo de DNA. Os extratos serão armazenados a -20°C até o teste de PCR (9).

Identificação de S. pneumoniae A identificação de S. pneumoniae será obtida pela amplificação do gene lytA usando primers e sondas recomendados pelo CDC e Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, EUA) (10). Amostras positivas para LytA serão posteriormente analisadas para identificação do sorotipo.

Identificação de sorotipo Ensaios de PCR multiplex convencionais serão realizados como uma série de reações multiplex, usando esquemas e primers recomendados pelo CDC para dedução de sorotipo pneumocócico e 2X PCR Buffer - QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Os produtos de PCR serão analisados ​​em géis de agarose NuSieve a 2% (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), corados com brometo de etídio. As imagens de gel serão gravadas no sistema BioDocAnalyze (Analytik Jena, Jena, Alemanha).

A PCR em tempo real será realizada opcionalmente em caso de dificuldades com a PCR convencional. A IT será realizada como uma série de 21 ensaios monoplex abrangendo 21 sorotipos usando esquemas recomendados pelo CDC com base na prevalência geográfica dos sorotipos. Os ensaios são multiplexados em um formato triplex sequencial (três alvos/sorotipos em uma reação), cada um detectando alvos nos canais FAM, Rox (ou Cy5) e Hex. As reações serão realizadas em Instrumentos ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA), utilizando primers e sondas específicos e Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA).

Teste de suscetibilidade A suscetibilidade de isolados de Spn a Optochin, Oxacilin, Norfloxacin, Eritromicina, Clindamicina, Tetraciclina e Trimetroprim-sulfometoxazole será determinada pelo método de difusão de acordo com o Comitê Europeu de Testes de Suscetibilidade Antimicrobiana (EUCAST, www.eucast.org).

Esta avaliação de linha de base está levando em consideração para apresentar resultados atuais apenas descritivos, mas eles não são levados em consideração separadamente para análise comparativa.

Os resultados dos exames laboratoriais, realizados para cada paciente, serão encaminhados aos médicos eleitos que indicaram a amostragem do material do paciente.

Procedimentos do estudo Os adultos serão recrutados durante seu exame de saúde no Centro de Saúde de Novi Sad por seu médico eleito.

Depois de fornecer uma explicação verbal e escrita do objetivo da pesquisa (Apêndice 1), o consentimento informado (Apêndice 2) será obtido dos participantes antes da inscrição. As informações pessoais e confidenciais obtidas dos participantes serão removidas, exceto informações demográficas, incluindo data da amostragem, idade, sexo, dados sobre infecção anterior do trato respiratório superior, número de filhos (irmãos) de 0 a 10 anos residentes na casa dos participantes com histórico de imunização pneumocócica e influenza (porque a imunização influenza pode prevenir superinfecções pneumocócicas), hábitos tabágicos dos participantes e membros de sua família e as informações sobre a residência domiciliar (Questionário de pesquisa - Apêndice 3).

As amostras serão fornecidas como um swab NP por sujeito do estudo. Cada participante será atribuído apenas uma vez.

Caso confirmado é todo participante testado em laboratório no qual, após teste (PCR ou ELISA), é obtido resultado positivo.

Análise Estatística e Justificativa do Tamanho da Amostra Coleta dos dados As características de todos os entrevistados adquiridos pelo questionário de Novi Sad, os resultados dos testes laboratoriais das amostras dos participantes e a caracterização final dos sorotipos Spn serão inseridos em um banco de dados especialmente projetado. As informações pessoais dos participantes serão removidas.

O investigador da pesquisa junto com o estatístico analisará os dados coletados.

Justificativa do tamanho da amostra De acordo com o cálculo do tamanho da amostra para um estudo de estimativa de prevalência populacional (11), planeja-se coletar entre 350 e 500 amostras. Presumimos detectar pneumococos em até 10% PCR-positivo para Spn. O número total de adultos com mais de 50 anos é de cerca de 120.000, pelo que esperamos recolher a amostra até 0,4% do total da população-alvo.

Resultados esperados Após a implementação cuidadosa da pesquisa, esperamos que o porte de Spn entre adultos com mais de 50 anos de idade esteja presente em menos de 10% da população total. Além disso, presumimos que os sorotipos Spn cobertos por PPV ou PCV representarão mais de 60% e 50% dos sorotipos na distribuição geral entre os indivíduos testados.

Métodos estatísticos Examinaremos associações entre fatores de risco e portadores de pneumococos NP e OP em participantes com mais de 50 anos. Os seguintes fatores serão examinados como possíveis fatores de risco na população coberta: idade, sexo, dados sobre infecção prévia do trato respiratório superior, número de crianças (irmãos) de 0 a 10 anos residentes no domicílio de participantes com histórico de imunização pneumocócica e influenza, hábitos tabágicos dos participantes e dos seus agregados familiares e as informações sobre a residência domiciliária. Esses fatores serão analisados ​​por análises univariadas e multivariadas (se apropriado). Além disso, será estimada a prevalência de portadores de NP e OP como a proporção de participantes cujas culturas nasofaríngeas foram positivas para Spn e correspondentes intervalos de confiança de 95%. Todas as análises descritivas serão realizadas no software SPSS Statistics versão 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EUA).