Pneumokokowe nosowo-gardłowe i ustno-gardłowe przenoszenie u dorosłych

Centrum badawcze:

Badania będą prowadzone przez:

1. Instytut Zdrowia Publicznego Wojwodiny

   • Centrum Kontroli i Zapobiegania Chorobom oraz Centrum Mikrobiologii

2. Centrum Opieki Zdrowotnej w Nowym Sadzie

   • Katedra Medycyny Ogólnej.

Przetwarzanie próbek Aby potwierdzić nosicielstwo NP i OP, pobieranie próbek będzie obejmować wymazówki NP i OP. Wymazy zostaną pobrane przez lekarzy pierwszego kontaktu w Centrum Opieki Zdrowotnej w Nowym Sadzie i przetransportowane w ciągu 24 godzin od pobrania do Centrum Mikrobiologii Instytutu Zdrowia Publicznego Wojwodiny w Nowym Sadzie. Sterylne waciki z bawełnianą końcówką zostaną wprowadzone do przednich nozdrzy, delikatnie wcierane w ściankę wymazówki NP i natychmiast umieszczone w podłożu transportowym (Copan Venturi Transystem, Brescia, Włochy).

Procedura laboratoryjna W laboratorium wymazy NP będą analizowane przez 200 μl pożywki STGG zaszczepionej wacikiem zostaną przeniesione do 5,0 ml bulionu Todd Hewitt zawierającego 0,5% ekstraktu drożdżowego (THY) i 1 ml surowicy króliczej i inkubowane w 35-37 °C przez sześć godzin. Hodowany bulion zostanie wysiany na agarze z krwią baranią i inkubowany w 5% CO2 w temperaturze 35-37 °C. Po 18-24 godzinach inkubacji płytki zostaną zbadane pod kątem pojawienia się kolonii alfa-hemolitycznych przypominających paciorkowce. Pozytywne próbki zostaną wyhodowane i przeprowadzony zostanie test rozpuszczalności dysku optochiny i żółci.

Serotypowanie molekularne

Ekstrakcja DNA W celu uzyskania ekstraktów DNA do reakcji PCR, hodowaną przez noc płytkę z agarem z krwią zawiesza się w 300 μl 0,85% NaCl, ogrzewa do 70°C przez 15 minut, wiruje przez 2 minuty i usuwa supernatant. Osad zostanie zawieszony w 50 μl buforu TE z dodatkiem 10 μl mutanolizyny i 8 μl hialuronidazy, przechowywany w 37°C przez 30 min (do nocy), ogrzewany przez 10 min w 100°C i wirowany przez 4 min. Nie więcej niż 2,5 μl supernatantu zostanie użyte jako matryca DNA. Ekstrakty będą przechowywane w temperaturze -20°C do czasu przeprowadzenia testu PCR (9).

Identyfikacja S. pneumoniae Identyfikacja S. pneumoniae zostanie osiągnięta poprzez amplifikację genu lytA przy użyciu starterów i sond zalecanych przez CDC i Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) (10). Próbki LytA dodatnie będą dalej analizowane w celu identyfikacji serotypu.

Identyfikacja serotypu Konwencjonalne multipleksowe testy PCR będą wykonywane jako serie reakcji multipleksowych, przy użyciu zalecanych przez CDC schematów i starterów do dedukcji serotypów pneumokoków oraz buforu 2X PCR — QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Niemcy). Produkty PCR będą analizowane na 2% żelach agarozowych NuSieve (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), barwionych bromkiem etydyny. Obrazy żelowe będą rejestrowane w systemie BioDocAnalyze (Analytik Jena, Jena, Niemcy).

Real Time PCR zostanie przeprowadzony opcjonalnie w przypadku jakichkolwiek trudności z konwencjonalnym PCR. Zostanie on przeprowadzony jako seria 21 testów monopleksowych obejmujących 21 serotypów przy użyciu zalecanych przez CDC schematów opartych na geograficznym rozpowszechnieniu serotypów. Testy są multipleksowane w formacie sekwencyjnego tripleksu (trzy cele/serotypy w jednej reakcji), z których każdy wykrywa cele na kanałach FAM, Rox (lub Cy5) i Hex. Reakcje zostaną przeprowadzone na urządzeniach ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), przy użyciu specyficznych starterów i sond oraz Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Badanie wrażliwości Wrażliwość izolatów Spn na Optochinę, oksacylinę, norfloksacynę, erytromycynę, klindamycynę, tetracyklinę i trimetroprim-sulfometoksazol zostanie określona metodą dyfuzyjną zgodnie z zaleceniami Europejskiego Komitetu ds. Badania Wrażliwości Drobnoustrojów (EUCAST, www.eucast.org).

Ta ocena wyjściowa ma na celu przedstawienie jedynie opisowych bieżących wyników, ale nie są one osobno brane pod uwagę w analizie porównawczej.

Wyniki badań laboratoryjnych, przeprowadzonych dla każdego pacjenta, zostaną przekazane wybranym lekarzom, którzy wskażą pobranie materiału od pacjenta.

Procedury badawcze Dorośli będą rekrutowani podczas badania lekarskiego w Centrum Opieki Zdrowotnej w Nowym Sadzie przez wybranego przez nich lekarza.

Po ustnym i pisemnym wyjaśnieniu celu badania (Załącznik 1), przed włączeniem do badania uzyskana zostanie świadoma zgoda (Załącznik 2). Dane osobowe i poufne uzyskane od uczestników zostaną usunięte, z wyjątkiem danych demograficznych, w tym daty pobrania, wieku, płci, danych dotyczących przebytej infekcji górnych dróg oddechowych, liczby dzieci (rodzeństwa) w wieku 0-10 lat mieszkających w gospodarstwie domowym uczestników z historią szczepień przeciwko pneumokokom i grypie (ponieważ szczepienie przeciwko grypie może zapobiegać nadkażeniom pneumokokowym), nawykami palenia tytoniu przez uczestników i domowników oraz informacjami o miejscu zamieszkania (Kwestionariusz Ankiety – Załącznik nr 3).

Próbki zostaną dostarczone jako jeden wymaz NP na osobę badaną. Każdy uczestnik zostanie przydzielony tylko raz.

Potwierdzonym przypadkiem jest każdy uczestnik przebadany laboratoryjnie, u którego po wykonaniu testu (PCR lub ELISA) uzyskano wynik pozytywny.

Analiza statystyczna i uzasadnienie wielkości próby Gromadzenie danych Charakterystyka wszystkich respondentów uzyskana za pomocą kwestionariusza z Nowego Sadu, wyniki badań laboratoryjnych próbek uczestników i ostateczna charakterystyka serotypów Spn zostaną wprowadzone do specjalnie zaprojektowanej bazy danych. Dane osobowe uczestników zostaną usunięte.

Badacz badań wraz ze statystykami przeanalizują zebrane dane.

Uzasadnienie wielkości próby Zgodnie z obliczeniami wielkości próby na potrzeby badania oceniającego częstość występowania w populacji (11), planuje się pobranie od 350 do 500 próbek. Przypuszczamy, że jesteśmy w stanie wykryć pneumokoki do 10% PCR-dodatnich dla Spn. Całkowita liczba osób dorosłych w wieku powyżej 50 lat wynosi około 120 000, dlatego spodziewamy się, że pobierzemy próbę do 0,4% całej populacji docelowej.

Oczekiwane wyniki Po starannej realizacji badań spodziewano się, że nosicielstwo Spn wśród osób dorosłych w wieku powyżej 50 lat będzie obecne u mniej niż 10% całej populacji. Ponadto zakładamy, że serotypy Spn objęte PPV lub PCV będą stanowić ponad 60% i 50% serotypów w ogólnej dystrybucji wśród badanych osób.

Metody statystyczne Zbadamy związki między czynnikami ryzyka a nosicielstwem pneumokoków NP i OP u uczestników w wieku powyżej 50 lat. Następujące czynniki będą badane jako możliwe czynniki ryzyka w populacji objętej badaniem: wiek, płeć, dane dotyczące przebytej infekcji górnych dróg oddechowych, liczba dzieci (rodzeństwa) w wieku 0-10 lat mieszkających w gospodarstwie domowym uczestników ze szczepieniami przeciwko pneumokokom i grypie, zwyczaje palenia tytoniu przez uczestników i domowników oraz informacje o miejscu zamieszkania. Czynniki te zostaną przeanalizowane za pomocą analiz jednowymiarowych i wielowymiarowych (w stosownych przypadkach). Oszacowana zostanie również częstość występowania nosicielstwa NP i OP jako odsetek uczestników, u których hodowle nosowo-gardłowe były pozytywne dla Spn i odpowiadające im 95% przedziały ufności. Wszystkie analizy opisowe zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania SPSS Statistics w wersji 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).