Pneumokokový nosohltanový a orofaryngeální přenos u dospělých

Výzkumná centra:

Výzkum bude provádět:

1. Ústav veřejného zdraví Vojvodiny

   • Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí a Centrum pro mikrobiologii

2. Centrum zdravotní péče v Novém Sadu

   • Klinika všeobecného lékařství.

Zpracování vzorku K potvrzení NP a OP bude odběr zahrnovat NP a OP výtěry. Výtěry odeberou praktičtí lékaři ve Středisku zdravotní péče v Novém Sadu a do 24 hodin od odběru je převezou do Centra mikrobiologie Ústavu veřejného zdraví Vojvodiny v Novém Sadu. Sterilní vatové tampóny se zavedou do předních nosních dutin, jemně se otřou na stěnu tamponu NP a okamžitě se umístí do transportního média (Copan Venturi Transystem, Brescia, Itálie).

Laboratorní postup V rámci laboratoře budou NP výtěry analyzovány tak, že 200 μl výtěrem naočkovaného STGG média se přenese do 5,0 ml Todd Hewitt bujónu obsahujícího 0,5% kvasinkový extrakt (THY) a 1 ml králičího séra a inkubuje se při 35-37 °C po dobu šesti hodin. Kultivovaný bujón bude nanesen na ovčí krevní agar a inkubován v 5% CO2 při 35-37 °C. Po 18-24 hodinách inkubace se misky vyšetří na výskyt alfa-hemolytických kolonií připomínajících streptokoky. Pozitivní vzorky budou kultivovány a provede se test optochinového disku a rozpustnosti žluči.

Molekulární sérotypizace

Extrakce DNA Pro získání extraktů DNA pro reakce PCR se růst krevní agarové plotny přes noc suspenduje ve 300 μl 0,85% NaCl, zahřívá se na 70 °C po dobu 15 minut, 2 minuty se centrifuguje a supernatant se odstraní. Peleta bude suspendována v 50 μl TE pufru s přídavkem 10 μl mutanolyzinu a 8 μl hyaluronidázy, udržována při teplotě 37 °C po dobu 30 minut (až přes noc), zahřívána po dobu 10 minut při teplotě 100 °C a odstřeďována po dobu 4 minut. Jako templát DNA nebude použito více než 2,5 μl supernatantu. Extrakty budou uchovávány při -20 °C až do testování PCR (9).

Identifikace S. pneumoniae Identifikace S. pneumoniae bude dosaženo amplifikací genu lytA pomocí primerů a sond doporučených CDC a Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, USA) (10). LytA pozitivní vzorky budou dále analyzovány pro identifikaci sérotypu.

Identifikace sérotypu Konvenční multiplexní PCR testy budou prováděny jako série multiplexních reakcí s použitím CDC doporučených schémat a primerů pro dedukci pneumokokových sérotypů a 2X PCR pufru - QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden, Německo). Produkty PCR budou analyzovány na 2% agarózových gelech NuSieve (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), obarvených ethidium bromidem. Gelové snímky budou zaznamenány systémem BioDocAnalyze (Analytik Jena, Jena, Německo).

Real Time PCR bude provedena volitelně v případě jakýchkoliv potíží s konvenční PCR. IT bude provedena jako série 21 monoplexních testů zahrnujících 21 sérotypů za použití schémat doporučených CDC založených na geografické prevalenci sérotypů. Testy jsou multiplexovány v sekvenčním triplexním formátu (tři cíle/sérotypy v jedné reakci), přičemž každý detekuje cíle na kanálech FAM, Rox (nebo Cy5) a Hex. Reakce budou prováděny na přístrojích ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), za použití specifických primerů a sond a Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA).

Testování citlivosti Citlivost izolátů Spn na Optochin, Oxacilin, Norfloxacin, Erytromycin, Clindamycin, Tetracyklin a Trimetroprim-sulfometoxazol bude stanovena difúzní metodou podle Evropské komise pro testování antimikrobiální citlivosti (EUCAST, www.eucast.org).

Toto základní hodnocení bere v úvahu, aby předložilo pouze popisné aktuální výsledky, ale nejsou samostatně brány v úvahu pro srovnávací analýzu.

Výsledky laboratorních testů provedených u každého pacienta budou předány zvoleným lékařům, kteří indikovali odběr vzorků materiálu pacienta.

Studijní postupy Dospělí budou přijati během jejich zdravotní prohlídky ve Health Care Center of Novi Sad svým zvoleným lékařem.

Po poskytnutí verbálního a písemného vysvětlení cíle výzkumu (Příloha 1) bude od subjektů před zápisem získán informovaný souhlas (Příloha 2). Osobní a důvěrné informace získané od účastníků budou odstraněny, s výjimkou demografických informací, včetně data odběru vzorků, věku, pohlaví, údajů o předchozí infekci horních cest dýchacích, počtu dětí (sourozenců) ve věku 0-10 let žijících v domácnosti účastníků s anamnézou imunizace proti pneumokokům a chřipce (protože imunizace proti chřipce může zabránit pneumokokovým superinfekcím), kuřácké návyky účastníků a členů jejich domácnosti a informace o domácím pobytu (dotazník průzkumu – příloha 3).

Vzorky budou poskytnuty jako jeden NP stěr na studijní subjekt. Každý účastník bude přidělen pouze jednou.

Potvrzeným případem je každý laboratorně testovaný účastník, u kterého je po testování (PCR nebo ELISA) získán pozitivní výsledek.

Statistická analýza a zdůvodnění velikosti vzorku Sběr dat Charakteristiky všech respondentů získané dotazníkem z Nového Sadu, výsledky laboratorních testů vzorků účastníků a konečná charakterizace sérotypů Spn budou vloženy do speciálně navržené databáze. Osobní údaje účastníků budou odstraněny.

Řešitel výzkumu spolu se statistikem budou analyzovat nasbíraná data.

Zdůvodnění velikosti vzorku V souladu s výpočtem velikosti vzorku pro studii odhadující prevalenci populace (11) se plánuje odebrání 350 až 500 vzorků. Předpokládáme detekci pneumokoků až u 10 % PCR-pozitivních na Spn. Celkový počet dospělých starších 50 let se pohybuje kolem 120 000, a proto předpokládáme sběr vzorku do 0,4 % z celkové cílové populace.

Očekávané výsledky Po pečlivé implementaci výzkumu jsme očekávali, že přenos Spn mezi dospělými staršími 50 let bude přítomen u méně než 10 % celkové populace. Kromě toho předpokládáme, že sérotypy Spn pokryté PPV nebo PCV budou představovat více než 60 % a 50 % sérotypů v celkové distribuci mezi testovanými subjekty.

Statistické metody Budeme zkoumat souvislosti mezi rizikovými faktory a NP a OP nosičstvím pneumokoků u účastníků starších 50 let. Jako možné rizikové faktory u sledované populace budou zkoumány následující faktory: věk, pohlaví, údaje o předchozí infekci horních cest dýchacích, počet dětí (sourozenců) ve věku 0-10 let žijících v domácnosti účastníků s imunizací proti pneumokokům a chřipce, kuřácké návyky účastníků a členů jejich domácnosti a informace o místě bydliště. Tyto faktory budou analyzovány jednorozměrnými a vícerozměrnými analýzami (pokud to bude vhodné). Rovněž bude odhadnuta prevalence nosičství NP a OP jako podíl účastníků, jejichž kultivace nosohltanu byly pozitivní na Spn a odpovídající 95% intervaly spolehlivosti. Všechny deskriptivní analýzy budou provedeny pomocí softwaru SPSS Statistics verze 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA).