Transporte neumocócico nasofaríngeo y orofaríngeo en adultos

Centros de investigación):

La investigación será realizada por:

1. Instituto de Salud Pública de Vojvodina

   • Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades y el Centro de Microbiología

2. Centro de Salud de Novi Sad

   • Departamento de Medicina General.

Procesamiento de muestras Para confirmar el estado de portador NP y OP, el muestreo incluirá hisopos NP y OP. Los médicos generales recogerán los hisopos en el Centro de Atención Médica de Novi Sad y los transportarán, dentro de las 24 horas posteriores a la recolección, al Centro de Microbiología del Instituto de Salud Pública de Vojvodina, Novi Sad. Los hisopos de alambre estériles con punta de algodón se insertarán en las fosas nasales anteriores, se frotarán suavemente en la pared del hisopo NP y se colocarán inmediatamente en un medio de transporte (Copan Venturi Transystem, Brescia, Italia).

Procedimiento de laboratorio Dentro del laboratorio, los hisopos NP se analizarán con 200 μl de medio STGG inoculado con hisopo, se transferirán a 5,0 ml de caldo Todd Hewitt que contiene un 0,5 % de extracto de levadura (THY) y 1 ml de suero de conejo y se incubarán a 35-37 °C durante seis horas. El caldo cultivado se sembrará en placas de agar sangre de carnero y se incubará en CO2 al 5 % a 35-37 °C. Después de 18 a 24 horas de incubación, se examinarán las placas para detectar la aparición de colonias alfa-hemolíticas parecidas a estreptococos. Las muestras positivas se cultivarán y se realizará una prueba de disco de optoquina y solubilidad en bilis.

Serotipificación molecular

Extracción de ADN Para obtener extractos de ADN para las reacciones de PCR, se suspenderá una placa de agar sangre durante la noche en 300 μl de NaCl al 0,85 %, se calentará a 70 °C durante 15 min, se centrifugará durante 2 min y se eliminará el sobrenadante. El sedimento se suspenderá en 50 μl de tampón TE con una adición de 10 μl de mutanolisina y 8 μl de hialuronidasa, se mantendrá a 37 °C durante 30 min (hasta toda la noche), se calentará durante 10 min a 100 °C y se centrifugará durante 4 min. No se utilizarán más de 2,5 μl de sobrenadante como plantilla de ADN. Los extractos se almacenarán a -20 °C hasta la prueba de PCR (9).

Identificación de S. pneumoniae La identificación de S. pneumoniae se logrará amplificando el gen lytA utilizando cebadores y sondas recomendados por los CDC y Quanta Biosciences PerfeCTa1 qPCR ToughMix1, Low RoxTM (Quanta Biosciences, Beverly, EE. UU.) (10). Las muestras positivas para LytA se analizarán más a fondo para identificar el serotipo.

Identificación de serotipos Los ensayos de PCR multiplex convencionales se realizarán como una serie de reacciones multiplex, utilizando los esquemas y cebadores recomendados por los CDC para la deducción de serotipos neumocócicos y el tampón de PCR 2X: kit QIAGEN Multiplex PCR (Qiagen, Hilden, Alemania). Los productos de PCR se analizarán en geles de agarosa NuSieve al 2 % (Cambrex Bio Science, Inc., Rockland, ME), teñidos con bromuro de etidio. Las imágenes en gel se registrarán en el sistema BioDocAnalyze (Analytik Jena, Jena, Alemania).

La PCR en tiempo real se realizará opcionalmente en caso de que surjan dificultades con la PCR convencional. Se realizará TI, como una serie de 21 ensayos monoplex que abarcan 21 serotipos utilizando los esquemas recomendados por los CDC basados ​​en la prevalencia geográfica de los serotipos. Los ensayos se multiplexan en un formato triplex secuencial (tres objetivos/serotipos en una reacción), cada uno de los cuales detecta objetivos en los canales FAM, Rox (o Cy5) y Hex. Las reacciones se realizarán en instrumentos ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.), utilizando cebadores y sondas específicos e Invitrogen-Platinum Quantitive PCR SuperMix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.).

Pruebas de susceptibilidad La susceptibilidad de los aislados de Spn a optoquina, oxacilina, norfloxacina, eritromicina, clindamicina, tetraciclina y trimetroprim-sulfometoxazol se determinará mediante el método de difusión según el Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST, www.eucast.org).

Esta evaluación de referencia se tiene en cuenta para presentar solo los resultados actuales descriptivos, pero no se tienen en cuenta por separado para el análisis comparativo.

Los resultados de las pruebas de laboratorio, realizadas para cada paciente, se enviarán a los médicos electos que indicaron el muestreo del material del paciente.

Procedimientos del estudio Los adultos serán reclutados durante su examen de salud en el Centro de Atención de la Salud de Novi Sad por su médico elegido.

Después de proporcionar una explicación verbal y escrita del objetivo de la investigación (Apéndice 1), se obtendrá el consentimiento informado (Apéndice 2) de los sujetos antes de la inscripción. Se eliminará la información personal y confidencial obtenida de los participantes, excepto la información demográfica, incluida la fecha del muestreo, la edad, el sexo, los datos sobre infecciones previas del tracto respiratorio superior, la cantidad de niños (hermanos) de 0 a 10 años que residen en el hogar de los participantes. con antecedentes de vacunación contra el neumococo y la influenza (porque la vacunación contra la influenza puede prevenir las sobreinfecciones por neumococo), hábitos de fumar de los participantes y los miembros de su hogar y la información sobre la residencia en el hogar (Cuestionario de la encuesta - Apéndice 3).

Las muestras se proporcionarán como un hisopo NP por sujeto de estudio. Cada participante será asignado una sola vez.

Caso confirmado es todo participante sometido a pruebas de laboratorio en el que, después de la prueba (PCR o ELISA), se obtiene un resultado positivo.

Análisis estadístico y justificación del tamaño de la muestra Recopilación de los datos Las características de todos los encuestados adquiridas mediante el cuestionario de Novi Sad, los resultados de las pruebas de laboratorio de las muestras de los participantes y la caracterización final de los serotipos de Spn se ingresarán en una base de datos especialmente diseñada. La información personal de los participantes será eliminada.

El investigador de la investigación junto con el estadístico analizarán los datos recopilados.

Justificación del tamaño de la muestra De acuerdo con el cálculo del tamaño de la muestra para un estudio de estimación de prevalencia poblacional (11), se prevé recolectar entre 350 y 500 muestras. Presumimos detectar neumococos hasta en un 10% PCR positivo a Spn. El número total de adultos mayores de 50 años es de alrededor de 120.000, por lo que esperamos recoger la muestra hasta el 0,4 % de la población objetivo total.

Resultados esperados Después de una cuidadosa implementación de la investigación, esperábamos que la portadora de Spn entre adultos mayores de 50 años estuviera presente en menos del 10% de la población total. Además, suponemos que los serotipos Spn cubiertos por PPV o PCV representarán más del 60 % y el 50 % de los serotipos en la distribución general entre los sujetos evaluados.

Métodos estadísticos Examinaremos las asociaciones entre los factores de riesgo y la portación de neumococos NP y OP en participantes mayores de 50 años. Se examinarán los siguientes factores como posibles factores de riesgo en la población cubierta: edad, sexo, datos sobre infecciones previas de las vías respiratorias superiores, número de niños (hermanos) de 0 a 10 años que residen en el hogar de los participantes con antecedentes de vacunación antineumocócica e influenza, hábitos de fumar de los participantes y los miembros de su hogar y la información sobre la residencia en el hogar. Estos factores se analizarán mediante análisis univariados y multivariados (si procede). Además, se estimará la prevalencia de portadores de NP y OP como la proporción de participantes cuyos cultivos nasofaríngeos fueron positivos para Spn y los correspondientes intervalos de confianza del 95%. Todos los análisis descriptivos se realizarán utilizando el software SPSS Statistics, versión 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.).